周 敏 郭建峰

當(dāng)前肺癌位于惡性腫瘤全球發(fā)病率和死亡率第一位，不過生長分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移比較晚，患者早期沒有特征性臨床癥狀[1-2]。手術(shù)為肺癌的主要根治方法，但是很多患者在確診時失去了手術(shù)治療指征。現(xiàn)代研究顯示肺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移是1個涉及多因素、多過程、多步驟的復(fù)雜漫長過程，抑癌基因的缺失或表達(dá)失調(diào)是肺癌發(fā)生與發(fā)展的主要原因之一[3-4]。MicroRNAs(miRNAs)是1類進(jìn)化高度保守、內(nèi)源性的小分子編碼RNA，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物學(xué)事件[5-6]。miRNAs與肺癌的發(fā)生與發(fā)展有顯著相關(guān)性，當(dāng)前研究顯示miR-222異常表達(dá)與肺癌的惡性轉(zhuǎn)化、臨床預(yù)后、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、浸潤轉(zhuǎn)移等有一定關(guān)系，其作用機制尚未完全清楚[7-8]。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，人mTOR基因編碼由2549個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的增殖與凋亡過程中起著中心調(diào)控點的作用，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[9-11]。本文具體探討了miR-222對肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性影響及其機制。現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

研究時間為2017年2月到2018年1月，人肺癌A549細(xì)胞系購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，保存在本實驗室；miR-222 mimics、miR NC、miR-222 inhibitor購自上海吉瑪公司；羊抗鼠PTEN、Akt、mTOR抗體與GAPDH內(nèi)參抗體購自Santa Cruz 公司；QuickShuttle轉(zhuǎn)染試劑購自Sigma公司；Annexin V FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海生工公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞胰酶消化后，以1×106細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。適量miR-222 mimics(實驗組)、miR NC(對照組)、miR-222 inhibitor(抑制組)轉(zhuǎn)移至離心管中，使得終濃度為50 nM。將miRNAs與轉(zhuǎn)染試劑混合液加入培養(yǎng)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染完成后采用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h提取各組細(xì)胞的總RNA，采用qRT-PCR方法檢測miR-222表達(dá)情況。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，各組細(xì)胞孔中加入20 μl 0.5 mg/ml MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min后使用酶標(biāo)儀540 nm波長處檢測細(xì)胞光密度，檢測與計算增殖活性。

1.4 雙染法檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，各組細(xì)胞采用無菌PBS洗滌2遍，用250 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml左右，取200 μl的細(xì)胞懸液加入10 μl的Annexin-FITC，再加入10 μl濃度20 μg/ml的PI錠，室溫避光孵育10 min，加入500 μl PBS進(jìn)行重懸，在上流式細(xì)胞儀讀數(shù)與記錄細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 Western-blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h后在各組細(xì)胞中加入400 μl的RIPA裂解液，用槍頭反復(fù)吹打均勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清測定蛋白濃度后。取20 μg蛋白跑SDS-PAGE膠，采用Western-blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，一抗(1∶1 000)、4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)37 ℃放置30 min，采用Odyssey熒光檢測儀檢測目的條帶，使用GAPDH作為內(nèi)參。

上述實驗都重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.00軟件進(jìn)行分析，結(jié)果中的計量數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示，兩組與多組間比較采用t檢驗、單因素方差分析(one-wayANOVA)，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-222表達(dá)對比

轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組中miR-222表達(dá)水平顯著上調(diào)，抑制組顯著降低，與對照組對比差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組轉(zhuǎn)染后48 h的miR-222相對表達(dá)量對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.2 細(xì)胞增殖活性對比

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實驗組的細(xì)胞增殖活性顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點的細(xì)胞增殖活性對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.3 細(xì)胞凋亡率對比

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實驗組的細(xì)胞凋亡率顯著低于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點的細(xì)胞凋亡率對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.4 PI3K/AKT/mTOR蛋白表達(dá)對比

轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組的m-TOR蛋白表達(dá)水平顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，三組PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 三組轉(zhuǎn)染后48h的PI3K/AKT/mTOR蛋白表達(dá)對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

3 討論

當(dāng)前肺癌對人們健康的威脅日益嚴(yán)重，雖然當(dāng)前治療方法與藥物不斷推陳出新，但患者的5年生存率并沒有顯著提高[12]。因此尋找影響肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子標(biāo)志物，對早期診治肺癌具有重要的價值。miRNAs是1類長約22nts的單鏈RNA，屬內(nèi)源性非編碼小RNA，人體基因組中超過1/3的蛋白編碼基因可能受miRNAs調(diào)控，各種因素所導(dǎo)致的miRNAs表達(dá)異常，都可造成機體產(chǎn)生疾病[13-14]。

miR-375 mimic的導(dǎo)入能夠模擬細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性miR-222，建立miRNA過表達(dá)的模型；而miRNA inhibitor是可以與miR-222完全互補的反義寡核苷酸序列，轉(zhuǎn)染后可抑制miRNA的功能[15]。本研究轉(zhuǎn)染后檢測顯示發(fā)現(xiàn)mimic組miR-22的表達(dá)水平顯著高于對照組，抑制組miR-222的表達(dá)水平顯著低于對照組，表明本研究成功地建立了miR-22過表達(dá)及體系抑制表達(dá)的瞬時表達(dá)。當(dāng)前研究表明miR-222可參與多種腫瘤的形成和發(fā)展，在頭頸部、胰腺癌、肝癌、胃癌腫瘤中呈高表達(dá)狀況[16-17]。本研究顯示轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組中miR-222表達(dá)水平顯著上調(diào)，抑制組顯著降低，與對照組對比差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實驗組的細(xì)胞增殖活性顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明miR-222的過表達(dá)能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。最近研究顯示miR-222的過表達(dá)使肺癌細(xì)胞A549侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，促使基底膜降解增多，破損處增多，利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖[18-19]。

miRNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是1種重要的表觀遺傳學(xué)手段，于人體內(nèi)miRNAs已超過千種，調(diào)控了人體內(nèi)60%的功能基因的表達(dá)，并在細(xì)胞增殖、凋亡等多個生理過程中發(fā)揮著重要作用，其可通過間接或直接的方式參與疾病的病理進(jìn)程[20]。細(xì)胞凋亡情況是反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，本研究顯示轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實驗組的細(xì)胞凋亡率顯著低于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)前也有研究顯示miR-222具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，它可通過激活A(yù)KT通路促進(jìn)活性氧的釋放，最終抑制凋亡的發(fā)生[21-22]。

某一特定miRNA可同時作用多個靶基因，而同1個基因又可受到多個miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[23]。有研究顯示PI3K是miR-222的靶基因，它可通過下調(diào)PIK3受體表達(dá)抑制下游信號而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[24]。本研究顯示轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組的m-TOR蛋白表達(dá)水平顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，三組PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此推測miR-222可通過間接影響P13K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)實現(xiàn)對肺癌的調(diào)控作用。當(dāng)前也有研究表明miR-222的高表達(dá)可使PI3K激酶活性相對增強，激活PI3K/AKT/mTOR信號途徑，利于腫瘤細(xì)胞的增殖[25]。

綜上所述，miR-222基因過表達(dá)可通過激活A(yù)kt-mTOR信號通路，降低肺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)，提高細(xì)胞增殖活性，從而發(fā)揮促癌作用。