劉林莉 ，廖倩 ，汪瀚文 ，歐陽飛 ，魯青蓮 ，劉婷婷 ，房慧 ，萬焰 ，于春水

（1.遂寧市中心醫(yī)院，四川遂寧629000；2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

當歸多糖（Angelica polysaccharide，APS）為當歸中提取的活性物質(zhì)，其有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等多種功能。永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT）是一種永生化的、有潛在分化能力的細胞，常作為研究角質(zhì)形成細胞生理功能的模型。高通量測序是近年來一個熱門的技術(shù)，主要特點是測序通量高，測序時間和成本顯著下降。本研究中，我們運用高通量RNA測序APS對HaCaT細胞的影響，尋找差異基因（DEGs），進行DEGs的功能富集，探討APS對角質(zhì)形成細胞的影響。以期為角化異常的皮膚疾病的治療機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取HaCaT細胞置于MEM培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，每2天換液、傳代，取3代或4代HaCaT細胞的單細胞混懸液。從傘形科植物當歸的干燥根中提取APS，標志性成分（APS）經(jīng)UV檢測，本實驗設(shè)定濃度為200 ng/μL。3組HaCaT細胞用同樣濃度（200 ng/μL）的APS處理后作為實驗組；3組不加APS培養(yǎng)的HaCaT為對照組。6組標本送往上海庚思生物有限公司進行高通量RNA測序。

1.2 主要試劑、儀器 RNAiso Plus（Trizol）（廠商Takara，貨號 9109）、Qubit2.0 RNA 檢測試劑盒（廠商 Life、貨號 Q32855）、Qubit2.0熒光計（型號Q32866，廠商Invitrogen）、臺式高速低溫離心機（型號Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R、生產(chǎn)商Thermo）、電泳儀（型號DYY-11，廠商北京市六一儀器廠）、生物電泳圖像分析系統(tǒng)（型號FR-980A、廠商復(fù)日科技）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取 在6組HaCaT細胞中分別加入Trizol試劑（Takara，貨號 9109）混勻，按照 Trizol試劑說明書提取總RNA。再使用Qubit2.0RNA檢測試劑盒（廠商Life，貨號Q32855）予以RNA純化。

1.3.2 RNA文庫的構(gòu)建及測序 總RNA用瓊脂凝膠電泳分離后予以回收純化，純化回收產(chǎn)物予以PCR擴增，擴增后采用Illumina Hiseq平臺進行測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)分析 Illumina Hiseq平臺的測序數(shù)據(jù)經(jīng)以下流程進行分析：①數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控：對測序的原始數(shù)據(jù)通過FastQC進行質(zhì)量評估，通過Trimmomatic進行質(zhì)量剪切，得到相對準確的有效數(shù)據(jù)。②表達水平分析：使用StringTie和已知的基因模型評估基因的表達量；使用WGCNA進行基因共表達分析；基于樣本的表達量矩陣進行樣本比較分析等多方向的統(tǒng)計分析和探索。③表達差異分析：使用DESeq2進行基因表達差異分析，對表達差異分析結(jié)果進行可視化；將DEGs映射到STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；基于差異分析結(jié)果，繪制韋恩圖、熱圖，并進行聚類分析。④基因富集分析：使用top（Gene Ontology GO）進行GO富集分析；使用clusterProfiler進行KEGG通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用DESeq2進行基因表達差異分析，用topGO進行GO富集分析，使用ClusterProfiler進行KEGG通路富集分析。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs表達結(jié)果 DEGs的篩選需要嚴格的標準，其篩選條件設(shè)定為：qValue<0.05且差異倍數(shù)|FoldChange|>2。本實驗中，經(jīng)APS處理后的HaCaT和對照組比較，共有84個顯著性DEGs表達，其中有33個顯著基因表達上調(diào)，51個顯著基因表達下調(diào)，其表達差異火山圖見圖1。

橫軸為基因在不同組樣本間的表達差異倍數(shù)fold-change[log2（B/A）]值，縱軸為代表基因表達量變化的統(tǒng)計學(xué)顯著程度pValue，pValue越小，-log10（pValue）越大，差異越顯著。圖中每個點代表一個基因，其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，黑色表示非DEGs。

圖1 比較組表達差異火山圖

2.2 GO功能富集分析 根據(jù)P<0.05篩選出2組的差異表達基因進行GO富集。GO是一個國際標準化的基因功能分類體系，以全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。分別從基因的分子功能（Molecular function）、細胞組分（Cellular component）、生物過程（Biological process）這3個方面來進行GO功能富集分析。主要結(jié)果顯示為Ⅰ型干擾素（IFN）信號通路、免疫反應(yīng)、細胞因子應(yīng)答等生物過程表達下調(diào)，見表2。

2.3 京都基因和基因組百科全書富集通路分析（KEGG） KEGG是一個有關(guān)生物系統(tǒng)較完善的數(shù)據(jù)庫，整合了基因組、化學(xué)物質(zhì)和系統(tǒng)功能信息。選出DEGs后，研究DEGs在注釋功能中的分布狀況將闡明樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。本實驗部分顯著性DEGs的富集通路主要集中在生物激素的合成、氨基酸的代謝等通路，見表3。

3 討論

當歸是一種傳統(tǒng)的藥用和食用植物，長期用于補益，補血，活血化瘀，止痛，潤腸，治療女性月經(jīng)不調(diào)和閉經(jīng)[1]。APS為當歸中提取的一種高活性物質(zhì)，主要有提高免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、消炎鎮(zhèn)痛、保肝作用以及降血糖和神經(jīng)保護等多種作用[2]。在皮膚方面，王剛等[3]發(fā)現(xiàn)，APS通過對轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 及白細胞介素（IL）-1α 的表達有顯著的調(diào)節(jié)作用，影響真皮成纖維細胞Ⅲ型膠原的分泌，從而促進成纖維細胞增殖，提示APS可能在皮膚創(chuàng)面愈合中起重要作用。也有研究表明，APS可以抑制肥大細胞的活化，從而抑制炎細胞因子和變應(yīng)性介質(zhì)的釋放，有一定的抗過敏作用[4]。已經(jīng)證實APS對角質(zhì)形成細胞的凋亡有促進作用[5]，同時可抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB活化、減少IFN-γ分泌，從而對銀屑病發(fā)揮治療作用[6]。HaCaT細胞是永生化的人角質(zhì)形成細胞，常常作為銀屑病的研究模型。

表2 通過P＜0.05篩選得到APS實驗組和對照組的DEGs，對DEGs進行GO功能富集

表3 根據(jù)P＜0.05，篩選得到APS實驗組和對照組的DEGs，對其進行Pathway顯著性分析

本研究中，筆者采用的RNA-seq的方法，檢測了APS處理HaCaT后的差異基因，并予以GO功能富集和KEGG通路富集分析。在DEGs表達中，共有84個顯著性DEGs表達，其中有33個顯著基因表達上調(diào)，51個顯著基因表達下調(diào)。GO功能富集顯示為Ⅰ型IFN信號通路、免疫反應(yīng)、細胞因子應(yīng)答等生物過程表達下調(diào)，說明APS可抑制Ⅰ型IFN信號通路、免疫反應(yīng)、細胞因子應(yīng)答等生物過程。最顯著的為Ⅰ型IFN信號通路表達下調(diào)。銀屑病是多基因遺傳背景下的T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，主要以角質(zhì)形成細胞過度增生、炎癥細胞浸潤、新生血管形成作為組織病理改變。銀屑病患者的皮膚中，Ⅰ型IFN信號傳導(dǎo)途徑被激活，Ⅰ型IFN信號傳導(dǎo)組分的表達顯著增加[7]。根據(jù)IFN的來源、序列、活性等可將其分為Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN。Ⅰ型IFN是針對病毒和細菌感染而產(chǎn)生的，并且在宿主的防御機制中起關(guān)鍵作用。Ⅱ型IFN包括IFN-γ，IFN-γ主要由活化的T細胞、樹突細胞和NK細胞產(chǎn)生，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Ⅰ型IFN中IFN-α和IFN-β最豐富。據(jù)文獻報道，IFN-α可誘發(fā)銀屑病的發(fā)生[8]。IFN-α誘發(fā)銀屑病的機制可能如下：①由于IFN-α信號傳導(dǎo)通路的活化，使得表皮中的浸潤性CD8+T細胞對IFN-α過度反應(yīng)；②增加的IFN-α介導(dǎo)的反應(yīng)包括IFN-γ的產(chǎn)生；③IFN-γ觸發(fā)樹突細胞的成熟和活化，以及角質(zhì)形成細胞的活化和過度增殖，由樹突細胞和角質(zhì)形成細胞生長因子，趨化因子，黏附分子，和炎性介質(zhì)隨后表達使得炎癥的持久浸潤，最終維持慢性銀屑病損傷[9]。所以IFN-α在銀屑病發(fā)病機制中起間接作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，APS可以抑制Ⅰ型IFN信號通路，抑制IFN-α的活化，減輕免疫反應(yīng)，減少炎癥的浸潤，從而緩解銀屑病的損傷，對于慢性銀屑病可以起到治療作用。同時銀屑病也是多種細胞因子參與應(yīng)答而導(dǎo)致免疫異常的疾病，而富集通路顯示APS可以抑制免疫反應(yīng)，抑制細胞應(yīng)答，從而發(fā)揮對銀屑病的治療作用。

本實驗從平基因表達水平來研究APS對角質(zhì)形成細胞的影響，發(fā)APS有抑制角質(zhì)形成細胞異常免疫的作用，從而以達到治療銀屑病的作用。但本實驗數(shù)據(jù)較泛雜，有待深入研究來探討APS是如何具體來抑制角質(zhì)形成細胞的異常免疫，為未來角質(zhì)異常的皮膚的治療開拓新的路徑和基礎(chǔ)。