陳 康，傅 強，盧建強，梁培松，韓 慧，董 謙，王偉佳

(廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528403)

銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、角膜炎等多種機會感染[1-2]。盡管抗菌藥物可以殺傷細菌，卻不能抑制因感染而激發(fā)的過度免疫應(yīng)答。因此，如何有效抑制過度免疫應(yīng)答是預(yù)防免疫病理損傷和治療疾病的關(guān)鍵。糖原合成激酶3β(GSK3β)是組織器官中廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與糖原合成，多種病理生理過程，如高血壓、糖尿病、炎性腸病等[3-5]。此外，還可參與多種病原體感染引起的免疫應(yīng)答，如病毒、真菌等[6-7]。磷酸化是調(diào)節(jié)GSK3β活性最常見的方式，其中以失活型9位絲氨酸(Ser9)的磷酸化最為常見，當(dāng)Ser9的磷酸化水平降低時，提示在該疾病中GSK3β活性增高，破壞細胞的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。絲裂原活性蛋白激酶(MAPK)是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)通路中的重要分子，GSK3β可與MAPK家族中成員包括p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)協(xié)同調(diào)控細胞的炎性反應(yīng)。GSK3β還可參與多種疾病的調(diào)控，被用作疾病治療的靶點。GSK3β的小分子抑制劑SB216763可抑制其活性，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[8]，因此本研究旨在探討感染銅綠假單胞菌時，GSK3β抑制劑調(diào)節(jié)細胞因子分泌及免疫功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1試劑 GSK3β抑制劑SB216763、p38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125均購自美國MCE公司；p38、磷酸化p38(P-p38)、JNK、磷酸化JNK(P-JNK)、ERK、磷酸化ERK(P-ERK)、磷酸化GSK3β失活型9位絲氨酸[P-GSK3β(Ser9)]和β-actin的抗體均購自美國CST公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；異丙醇和無水乙醇購自中國廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量PCR(qPCR)檢測用SYBR Green試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞購自美國菌種保藏中心，細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中。將4×105個/mL 小鼠巨噬細胞鋪入12孔細胞培養(yǎng)板中，采用GSK3β抑制劑(10 μmol/L)、p38抑制劑(1 μmol/L)或JNK抑制劑(1 μmol/L)預(yù)處理細胞1 h，加入銅綠假單胞菌(MOI=1)刺激后，檢測蛋白或mRNA水平的表達。

1.3免疫印跡試驗(Western blot) 用冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞培養(yǎng)板中的細胞2次，加入蛋白裂解液，收集細胞裂解碎片，冰上裂解20 min。12 000 r/min離心10 min，收集蛋白裂解上清，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。接著進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將膜用5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，4 ℃過夜分別孵育一抗p38(1∶1 000)、P-p38(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)、P-ERK(1∶1 000)、P-GSK3β(Ser 9)(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，室溫下孵育二抗1 h，采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測蛋白水平。

1.4qPCR RNA抽提試劑法進行RNA提取，分光光度計測RNA濃度和純度，用于下一步實驗。將提取后的RNA(1 μg)轉(zhuǎn)錄為cDNA，詳細步驟如下：RNA 1 μg，oligo(dT)1 μL，補DEPC水至體積12 μL，混勻；65 ℃，5 min；每孔加入5×反應(yīng)液4 μL，20 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，200 U/μL反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，至總體積20 μL，混勻；42 ℃，60 min，70 ℃，5 min終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄的cDNA保存?zhèn)溆?。?yīng)用SYBR Green試劑盒進行擴增，詳述如下：SYBR Green(2×) 10 μL，引物上下游混合液(5 μmol/L) 1.6 μL，cDNA模板2 μL，滅菌H2O補齊總體積20 μL充分混勻；按照兩步法PCR擴增程序，第1步，95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；第2步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后確認qPCR的擴增曲線和溶解曲線，得到循環(huán)閾值(Ct)值，采用2-ΔΔCT法進行相對定量。IL-10、IL-6和β-actin的引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1GSK3β參與到銅綠假單胞菌感染中 實驗結(jié)果顯示，在銅綠假單胞菌感染小鼠巨噬細胞6 h后，P-GSK3β(Ser9)水平增高，然后隨感染時間的增加，水平下調(diào)。這些結(jié)果提示，GSK3β參與到銅綠假單胞菌感染中。見圖1。

2.2GSK3β抑制劑調(diào)節(jié)細胞因子的表達 實驗結(jié)果顯示，在銅綠假單胞菌感染巨噬細胞后，GSK3β抑制劑SB216763可促進細胞因子IL-10水平的表達，同時抑制細胞因子IL-6水平的表達。結(jié)果提示抑制GSK3β可在銅綠假單胞菌感染中發(fā)揮免疫負調(diào)的作用。見圖2。

2.3GSK3β抑制劑調(diào)節(jié)MAPK家族成員的磷酸化水平 實驗結(jié)果顯示，在銅綠假單胞菌感染后15 min、30 min和2 h，GSK3β抑制劑可上調(diào)p38和JNK的磷酸化水平，而對ERK的磷酸化水平無調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)，細菌感染前后，GSK3β抑制劑對p38、JNK和ERK的蛋白水平無調(diào)節(jié)作用。見圖3。

注：A表示P-GSK3β(Ser9)蛋白表達水平隨感染時間的變化情況；B表示P-GSK3β(Ser9)蛋白表達定量隨感染時間的變化情況；***P<0.001
圖1 GSK3β參與到銅綠假單胞菌感染中

注：A表示IL-10基因水平表達情況；B表示IL-6基因水平表達情況；*P<0.05;***P<0.001
圖2 GSK3β抑制劑通過p38調(diào)節(jié)細胞因子的表達

圖3 GSK3β抑制劑調(diào)節(jié)MAPK的磷酸化水平

2.4GSK3β抑制劑通過p38調(diào)節(jié)細胞因子的表達 實驗結(jié)果顯示，GSK3β抑制劑可上調(diào)細胞因子IL-10的表達，在應(yīng)用GSK3β抑制劑的同時，應(yīng)用p38抑制劑可抑制細胞因子IL-10的表達，應(yīng)用JNK的抑制劑不可抑制IL-10的表達；GSK3β抑制劑可下調(diào)細胞因子IL-6的表達，在應(yīng)用GSK3β抑制劑的同時，應(yīng)用p38抑制劑可上調(diào)細胞因子IL-10的表達，而同時應(yīng)用JNK的抑制劑不可上調(diào)IL-10的表達。這些結(jié)果提示，GSK3β抑制劑通過p38 MAPK信號通路調(diào)節(jié)細胞因子的表達。見圖2。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在感染銅綠假單胞菌時，GSK3β活性增高；GSK3β抑制劑可通過p38調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，負調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

GSK3β參與到多種疾病的致病過程和病原體感染中[3-7]，因此被用作疾病治療的靶點。研究報道，GSK3β的抑制劑可發(fā)揮免疫調(diào)控的作用[8]。MARTIN等[9]報道，抑制GSK3β可抑制多種配體激活的炎性反應(yīng)，抑制促炎性細胞因子的表達，同時促進抑炎性細胞因子IL-10的表達。在敗血癥休克中，抑制GSK3β可上調(diào)抑炎性因子IL-10的表達[10]。然而，SHEN等[11]報道，GSK3β抑制劑SB216763可在心肌細胞中促進脂多糖誘導(dǎo)腫瘤壞死因子的表達。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β抑制劑SB216763可促進抑炎性細胞因子IL-10的表達，同時抑制促炎性細胞因子IL-6的表達，在銅綠假單胞菌感染中負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

GSK3β可參與多個信號通路的調(diào)控，可通過抑制NF-κB信號通路或上調(diào)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白抑制免疫應(yīng)答[12]。NOH等[10]報道，GSK3β抑制劑可通過抑制ERK的活性上調(diào)抑炎性因子IL-10的表達。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β抑制劑可上調(diào)p38和JNK的磷酸化水平，并通過p38 MAPK信號通路調(diào)節(jié)細胞因子IL-10和IL-6的表達，發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

在感染銅綠假單胞菌后，GSK3β的活性增高；應(yīng)用GSK3β的抑制劑SB216763可調(diào)節(jié)細胞因子的表達，負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，GSK3β抑制劑通過p38 MAPK信號通路調(diào)節(jié)細胞因子的表達。這些研究提示在銅綠假單胞菌感染中GSK3β可作為免疫調(diào)控的靶點。