謝潤(rùn)桂，何 怡，魏順娣，張曉燕

(東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東東莞 523107)

胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)是利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血中的胎兒游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行深度測(cè)序，并將結(jié)果進(jìn)行生物信息分享，可以從中獲得胎兒的遺傳信息[1]。目前NIPT已廣泛用于產(chǎn)前篩查，13-三體、18-三體和21-三體靈敏度和特異度[2]的檢測(cè)，但是，同任何篩查方法一樣，假陽(yáng)性和假陰性時(shí)常發(fā)生。通過(guò)臨床實(shí)踐與案例研究發(fā)現(xiàn)NIPT結(jié)果與實(shí)際胎兒核型之間存在差異，其發(fā)生率在0.1%～0.3%。該現(xiàn)象的生物學(xué)原因主要包括限制性胎盤(pán)嵌合、雙胎一胎凋亡、母親染色體異常、DNA拷貝數(shù)異常、母血中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等因素[3-5]。本文通過(guò)分析在東莞市婦幼保健院NIPT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的86例NIPT假陽(yáng)性病例，在胎兒分娩后留取的胎盤(pán)組織及母親外周血標(biāo)本，采用高通量測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證，探討NIPT產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因，以及相應(yīng)的預(yù)防措施。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年10月至2018年7月在東莞市婦幼保健院檢測(cè)出現(xiàn)的NIPT陽(yáng)性而羊水穿刺核型分析和CMA檢測(cè)驗(yàn)證胎兒染色體正常的假陽(yáng)性病例86例。在胎兒分娩后留取的胎盤(pán)組織及母親外周血標(biāo)本，采用高通量測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證。本研究經(jīng)東莞市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1樣本采集方法 樣本采集與孕婦分娩后，采集孕婦靜脈血7～10 mL，使用Cell-Free DNA BCT 管，采血后顛倒混勻8～10次，24 h后進(jìn)行血漿分離。同時(shí)進(jìn)行胎盤(pán)組織采樣，每個(gè)胎盤(pán)選6個(gè)采樣點(diǎn)，在胎盤(pán)的胎兒面和母體面分別間隔一定位置表層獲取3個(gè)黃豆大小(長(zhǎng)：0.5～1.0 cm,寬：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)的胎盤(pán)組織，用少量生理鹽水洗凈母血，分別按標(biāo)注置于對(duì)應(yīng)的2 mL無(wú)菌小型離心管中，最后將標(biāo)本以-20 ℃儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2高通量測(cè)序檢測(cè) 基因組DNA提取、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和質(zhì)量控制，用試劑盒提取基因組DNA，測(cè)定基因組DNA濃度，然后在-20 ℃保存。根據(jù)晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)量控制和匯集。使用半導(dǎo)體測(cè)序儀用于DNA測(cè)序。測(cè)序讀數(shù)被過(guò)濾并與人類(lèi)參考基因組(HG19)比對(duì)。

1.2.3NIPT假陽(yáng)性評(píng)估方法 NIPT檢測(cè)提示染色體異常，而胎兒染色體與羊水核型分析和CMA正常，則判定為NIPT假陽(yáng)性。本研究采用高通量測(cè)序法在胎兒出生后同時(shí)檢測(cè)胎盤(pán)和母親外周血中的染色體異常情況，將檢測(cè)結(jié)果與孕期檢測(cè)的NIPT結(jié)果對(duì)比，如果NIPT結(jié)果與胎盤(pán)測(cè)定結(jié)果一致，則判定NIPT假陽(yáng)性來(lái)源于胎盤(pán)細(xì)胞；如果NIPT結(jié)果與母血測(cè)定結(jié)果一致，則判定NIPT假陽(yáng)性來(lái)源于母體細(xì)胞。如果兩者檢測(cè)結(jié)果正常，無(wú)法判定NIPT假陽(yáng)性的來(lái)源，判定為未知來(lái)源。

2 結(jié) 果

經(jīng)高通量測(cè)序法檢測(cè)驗(yàn)證，在86例NIPT假陽(yáng)性標(biāo)本中64例胎盤(pán)檢測(cè)結(jié)果與NIPT相符，母血結(jié)果正常，占74.4%，其中檢測(cè)結(jié)果為性染色異常9例，常染色體異常55例；12例母血檢測(cè)結(jié)果與NIPT結(jié)果相符，胎盤(pán)結(jié)果正常，占14.0%，其中檢測(cè)結(jié)果為性染色異常10例，常染色體異常2例；10例胎盤(pán)與母血結(jié)果均正常，NIPT假陽(yáng)性來(lái)源不明，占11.6%。在64例胎盤(pán)來(lái)源假陽(yáng)性病例中有47例為限制性胎盤(pán)嵌合，占73.4%。NIPT檢測(cè)提示常染色體異常的63例中2例證實(shí)假陽(yáng)性來(lái)源于母血，占3.2%，而性染色體異常23病例中10例假陽(yáng)性病例來(lái)源于母血，占43.5%。見(jiàn)表1。

表1 86例NIPT假陽(yáng)性原因驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

孕婦外周血胎兒游離DNA(cffDNA)的NIPT是應(yīng)用高通量基因測(cè)序等分子遺傳技術(shù)檢測(cè)孕期母體外周血中胎兒游離DNA片段，以評(píng)估胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)[6]。母體外周血中cffDNA片段的濃度非常低(3%～6%)[7]。cffDNA具有獨(dú)特的生理性質(zhì)：(1)孕婦血漿中的cffDNA隨著孕周的增加而增加[8]；(2)cffDNA均有小片段形式存在，片段長(zhǎng)度大都小于300 bp；(3)清除速度快，cffDNA的半衰期為16.3 min，胎盤(pán)娩出后的2 h內(nèi)快速消除[9]。NIPT檢測(cè)母親外周血中的片段長(zhǎng)度為75～250 bp的cffDNA,并將游離DNA數(shù)量定位到染色體相應(yīng)的位置上，從而得到染色體不同位置DNA數(shù)量的比例關(guān)系，從而推斷染色體是否存在缺失、重復(fù)或數(shù)目異常。NIPT結(jié)果陽(yáng)性代表胎兒母親外周血中的各種cffDNA的比例關(guān)系不正常，可能是與母親血液系統(tǒng)相連通胎兒滋養(yǎng)層的異常核型細(xì)胞引起,也能是由母親異常核型細(xì)胞本身引起，也可能有一部分來(lái)源于通過(guò)輸血、免疫治療、器官移植等形式輸入體內(nèi)的外來(lái)異常核型細(xì)胞導(dǎo)致。母體外周血中cffDNA的來(lái)源以及含量變化等生物因素，都會(huì)影響NIPT檢測(cè)準(zhǔn)確性，表現(xiàn)為NIPT結(jié)果、染色體核型分析及CMA結(jié)果三者之間存在不一致情況[10-11]。

NIPT檢測(cè)的cffDNA絕大部分來(lái)源于胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與胎兒都是由同一個(gè)合子發(fā)育而來(lái)，將發(fā)育為胎盤(pán)，合子形成后，一部分細(xì)胞發(fā)育成胎盤(pán)的細(xì)胞系，一部分細(xì)胞發(fā)育成胎兒的細(xì)胞系。正常情況，兩者的遺傳物質(zhì)是相同的。如果胎盤(pán)細(xì)胞系的部分細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂錯(cuò)誤，那么將會(huì)出現(xiàn)限制性胎盤(pán)嵌合體，即胎盤(pán)出現(xiàn)正常與異常的染色體嵌合體，而胎兒核型正常[12]。這種情況胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞釋放cffDNA的分子劑量會(huì)異常，同時(shí)引起孕婦血漿中cffDNA的分子劑量異常，NIPT檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性，而胎兒染色體是正常的，即出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)NIPT假陽(yáng)性大部分來(lái)源于胎盤(pán)，占74.4%，其中大部分的胎盤(pán)來(lái)源假陽(yáng)性病例驗(yàn)證結(jié)果提示限制性胎盤(pán)嵌合體。因此胎盤(pán)來(lái)源的異常染色體是導(dǎo)致NIPT假陽(yáng)性的主要原因。

母體血漿DNA大部分來(lái)源于母體基因組，cffDNA約占10%～20%[13]。雖然在高通量測(cè)序前，經(jīng)過(guò)分離和純化去除了部分的母體基因組DNA，但是如果母血中存在異常DNA，仍會(huì)影響cffDNA的測(cè)定，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。性染色體異常在母血中最常見(jiàn)，其中性染色體嵌合是最常見(jiàn)的母體染色體嵌合異常，其發(fā)生率1/400[14]。由于女性擁有兩條X染色體，而且存在劑量補(bǔ)償和“選擇性失活”現(xiàn)象，女性的X染色體異常通常不會(huì)引起嚴(yán)重表型，其中X三體、嵌合型的X單體或X染色體的結(jié)構(gòu)異常女性一般都有生育能力[15]。而對(duì)于常染色體異常，數(shù)目異常者除21-三體外通常不能存活，也沒(méi)有生育能力，只有小片段的缺失或者重復(fù)攜帶者才能存活和生育，因此性染色體異常在母體中最常見(jiàn)，性染色體異常攜帶者比例高是導(dǎo)致母血來(lái)源的NIPT假陽(yáng)性的主要原因。本研究中12例母體來(lái)源假陽(yáng)性有10例是X染色體異常，說(shuō)明X染色體異常在孕婦中攜帶率最高。所以NIPT檢測(cè)時(shí)如果性染色體異常，很可能來(lái)源于母血，應(yīng)同時(shí)對(duì)母體白細(xì)胞進(jìn)行染色體檢測(cè)，以排除母體來(lái)源的可能，將會(huì)提高NIPT對(duì)性染色體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免病人妊娠期間不必要的緊張和壓力。

本研究還有10例假陽(yáng)性病例同時(shí)檢測(cè)了胎盤(pán)組織和母血均正常，NIPT假陽(yáng)性來(lái)源不明。NIPT檢測(cè)一般在孕早中期距離分娩有6、7個(gè)月時(shí)間，引起NIPT假陽(yáng)性的異常cffDNA可能已經(jīng)消失了，因此，本方法無(wú)法找到引起NIPT假陽(yáng)性原因。對(duì)游離DNA劑量變化的來(lái)源檢測(cè)還需要進(jìn)一步提高現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)。

高通量測(cè)序法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)和母血中異常游離DNA釋放入母血是NIPT假陽(yáng)性的主要原因。對(duì)NIPT結(jié)果為性染色體異常病例，應(yīng)排除性染色體異常源自母血的可能性。NIPT能夠準(zhǔn)確檢測(cè)母血總游離DNA的劑量變化，但無(wú)法分辨游離DNA劑量變化的來(lái)源。