李清琴，董荔紅，吳丹梅，鐘福春，張 朵

(聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院臨床遺傳與實驗醫(yī)學科，福建福州 350025)

據(jù)統(tǒng)計中國育齡夫婦中受不育不孕困擾的大約有10%～15%，其中男性因素約占50%[1]。精子核DNA完整性，是父源性遺傳信息能否準確傳遞給后代的關(guān)鍵。約20%的特發(fā)性不育癥存在精子DNA斷裂指數(shù)(DFI)高[2]。精子DFI高會降低卵母細胞的受精率、胚胎質(zhì)量及受孕率[3]。精子功能評價除了精液質(zhì)量分析外，增加精子DNA損傷檢測作為一項新指標，可預(yù)測自然受孕和體外受精的結(jié)局，監(jiān)測環(huán)境污染物和醫(yī)療干預(yù)誘發(fā)的精子DNA損傷，評估男性生殖系統(tǒng)疾病及其相關(guān)治療[4-5]。為探究精子DNA損傷的發(fā)病機理，本文綜合分析男性不育患者年齡、濃度、活力與精子DFI之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015-2017年，在聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院生殖中心治療不育癥患者的精液質(zhì)量參數(shù)和精子DFI作為研究對象，年齡分布在20～62歲，平均(32.9±5.3)歲。有正常夫妻生活的育齡夫婦，未采取任何避孕措施，女方1年以上未懷孕，即可診斷為不育癥。排除具有以下情況的不育癥患者：重度吸煙、男性生殖器官發(fā)育缺陷、精索靜脈曲張、生殖器官炎性反應(yīng)、全身性疾病、3個月內(nèi)服用可能影響精液常規(guī)的藥物、無精子癥等。

1.2方法

1.2.1精液分析 禁欲2～7 d后采集精液標本，37 ℃恒溫箱液化15～30 min。充分混勻后，采用手工法進行精液質(zhì)量分析。所有精液分析均由2名規(guī)范化培訓合格的技術(shù)人員操作完成，兩兩比對，進行嚴格的室內(nèi)質(zhì)控管理。根據(jù)《人類精液檢查與處理實驗室手冊第5版》標準，將精子運動分類為前向運動(PR)、非前向運動(NP)和不活動(IM)的精子。精液特性的部分參考值下限(95%CI)：精子濃度≥15×106/mL;精子總活力(PR+NP)≥40%，PR精子≥32%。根據(jù)精子活力(PR級精子比率)的強弱將弱精子癥分4類：輕度弱精子癥(20%≤PR<32%)、中度弱精子癥(10%≤PR<20%)、重度弱精子癥(1%≤PR<10%)、極度弱精子癥(PR<1%)。

1.2.2精子DFI檢測 流式細胞儀-精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法進行精子DFI檢測。具體如下：精液經(jīng)過低pH值的緩沖液處理后，精子核DNA鏈在斷裂處變性，吖啶橙熒光染色，通過BD FACS CnatoTMⅡ流式細胞儀收集熒光性號，Diva軟件進行數(shù)據(jù)分析。精子DFI值=有碎片化的精子數(shù)/被觀察的總精子數(shù)×100%，其中DFI值≤15%表示精子DNA完整性好；15%

1.2.3分組設(shè)計 觀察年齡對精子DFI的影響，將弱精子癥組(664例)和正常組(455例)根據(jù)年齡分為3組，年齡<30歲、年齡30～34歲、年齡>34歲。

1.3統(tǒng)計學處理 用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，選用非參數(shù)檢驗進行組間差異分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用多元線性回歸分析DFI與精液參數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1精子DFI與其他參數(shù)之間的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，精子DFI與年齡呈正相關(guān)(r=0.172，P<0.001)，與精子活力呈負相關(guān)(r=-0.457，P<0.001)，而與精子濃度無相關(guān)性。見表1。

表1 精子DFI與其他參數(shù)之間的相關(guān)性分析

2.2少、弱精子癥組和正常組的精子DFI比較 少、弱精子癥組的精子DFI分別為(27.2±15.0)%、(27.9±14.4)%，均明顯高于正常組的(16.8±8.5)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 少、弱精子癥組與正常組的精液質(zhì)量參數(shù)及精子DFI比較

2.3不同程度的弱精子癥之間的精子DFI比較 將664例弱精子癥患者根據(jù)精子活力的強弱分為輕度、中度、重度及極度弱精子癥4組，各組的精子DFI均值分別為(20.1±9.6)%、(27.6±13.4)%、(32.8±17.3)%，(40.1±20.2)%，異常率(異常率=DFI值小于30%的檢測例數(shù)/總檢測例數(shù)×100%)分別為17.2%、33.0%、51.1%、63.9%，均明顯高于正常組的異常率8.1%，尤其是重度和極度弱精子癥組。不同精子活力組間的DFI值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

表3 不同程度的弱精子癥之間的精子DFI比較

2.4年齡對精子DFI的影響 弱精子癥組中，各年齡組間的精子DFI比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著年齡增大，精子DFI明顯升高。而正常組中，各組間精子DFI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同年齡組精子DFI比較

3 討 論

男性生育能力的評估指標主要包括精液質(zhì)量分析、精漿生化、精子DFI等。雖然精液質(zhì)量分析被認為是男性生育力的金標準，但是其不能檢測精子分子水平的異常。精子DNA損傷影響DNA堿基對的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，直接導(dǎo)致了遺傳信息的缺失并影響生物轉(zhuǎn)化功能，從而阻礙胚胎形成[6]。前期研究顯示，當精子DFI超過30%時，自然生育率會大幅降低。

精子DNA損傷的病理生理機制尚未完全清楚，已報道的影響精子DFI的因素主要包括：(1)精子發(fā)生和成熟功能障礙如組蛋白-魚精蛋白轉(zhuǎn)換故障導(dǎo)致染色質(zhì)包裝異常；(2)男性生殖系統(tǒng)疾病或全身性疾病如炎性反應(yīng)、糖尿病、精索靜脈曲張、惡性腫瘤等；(3)生活方式包括吸煙、喝酒、飲食等；(4)環(huán)境因素如接觸紫外線、電離輻射、有毒化學物質(zhì)等；(5)其他因素，如年齡、禁欲時間、季節(jié)等[7-9]。

相關(guān)研究表明年齡增長，男性生育力下降、精液參數(shù)變差包括精子活動力降低、精子DNA損傷升高和精子形態(tài)異常率升高[10-11]。這可能因為年齡增加，活性氧(ROS)積累，高水平的ROS促進氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和進一步產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細胞凋亡或?qū)NA的氧化損傷[12]。與國內(nèi)外報道一致，本研究也發(fā)現(xiàn)年齡與精子DFI呈正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)弱精子癥組中，年齡>34歲的精子DFI顯著高于年輕≤34歲男性，>34歲組的異常率為40.9%，30～34歲組的異常率為32.5%、<30歲組的異常率為23.4%。而正常組中，年齡差異無統(tǒng)計學意義。

另一方面，男性不育中弱精子癥大約占19%，其特征是精子活力降低或無活力。精子運動的影響因素包括遺傳性疾病(內(nèi)臟逆位-鼻竇炎-支氣管擴張綜合征、囊性纖維化)，代謝和結(jié)構(gòu)綜合征(線粒體和鞭毛缺乏)，細胞凋亡等[13]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，精子DFI在弱精子癥患者中明顯升高，異常率高于正常組，尤其是重度和極度弱精子癥組，其升高水平與精子活力下降的程度有明顯的相關(guān)性。這可能是由于精子膜內(nèi)含有較高濃度的不飽和脂肪酸，過量ROS會誘導(dǎo)其發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使精子膜的流動性和完整性受到損傷，導(dǎo)致精子線粒體、精子核內(nèi)DNA受損。高水平的ROS釋放到細胞質(zhì)中，減少了精子活力的能量供應(yīng)，使精子活力降低，細胞凋亡，進而導(dǎo)致男性不育。MAHFOUZ等[14]發(fā)現(xiàn)精液中ROS水平增加25%，精子DFI大約會增加10%，精子活力大幅度下降。SHI[15]等研究也發(fā)現(xiàn)ROS水平增加，可能誘導(dǎo)精子氧化損傷，精子功能受損，精子活力可能是這種損傷最早和最敏感的指標之一。因此，筆者認為某些因素如過量ROS水平等會同時影響精子DNA損傷與精子活力。

綜上所述，精子DFI與精子活力呈負相關(guān)，且升高水平與精子活力的下降程度有關(guān)，提示精子DNA損傷可能存在與精子活力下降相同的影響機制。本研究還發(fā)現(xiàn)在弱精子癥患者中，精子DFI與年齡呈正相關(guān)，>34歲組中精子DFI顯著高于≤34歲組，提示年齡也是阻礙弱精子癥患者獲取孩子的不利因素之一。因此，男性不育患者應(yīng)正視并及早就醫(yī)。