溫江濤，王芙蓉，朱紅楠，嚴茹紅

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215153)

宮頸癌是一種常見女性惡性腫瘤。2018年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，全球?qū)m頸癌每年新發(fā)病例約57.0萬，死亡病例31.1萬，其中90%病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)是乳頭病毒科病毒，包括200多個亞型，其主要侵犯皮膚及黏膜上皮。根據(jù)致癌性的高低，HPV分為高危型、中危型和低危型[2-3]。高危型HPV感染易誘發(fā)多種惡性腫瘤，如宮頸癌、膀胱癌肉瘤、喉癌等[4]。低危型HPV感染常常引起濕疣等病變[5]。本研究主要分析江蘇省蘇州西部地區(qū)女性HPV感染與基因型分布情況，從而為該地區(qū)HPV感染的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2 195例于2017年11月至2018年5月在本院婦科門診自愿做HPV篩查的女性患者宮頸脫落細胞樣本。所有患者均符合：(1)長期居住于蘇州西部地區(qū)(>5年)；(2)至少有1年性生活史；(3)非妊娠期、無盆腔放療和化療史；(4)檢查前48 h內(nèi)無性生活史及用藥史等。

1.2儀器與試劑 全自動核酸提取儀與熒光定量PCR儀分別購自中國江蘇碩世生物技術(shù)有限公司和中國上海宏石有限公司；HPV病毒核酸提取及分型檢測試劑盒購自中國江蘇碩世生物技術(shù)有限公司。

1.3標本采集與保存 用宮頸刷置于宮頸口處沿順時針旋轉(zhuǎn)3～5圈采集宮頸口及宮頸管足夠的移行區(qū)上皮細胞，并迅速將宮頸刷頭部放入細胞保存液中，旋緊管蓋，若不能立即檢驗的樣品置于4 ℃冰箱保存，嚴格按照操作說明進行，應(yīng)避免反復凍融。

1.4檢測方法 樣本DNA提取和加樣：按照全自動核酸提取儀提取HPV-DNA。剩余DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存。將反應(yīng)液和A-H引物溶液依次加入PCR八聯(lián)管，再將2 μL待測樣本核酸溶液、陰性和陽性對照分別加入對應(yīng)的PCR八聯(lián)管。PCR擴增與變性：將PCR八聯(lián)管放入熒光PCR擴增儀內(nèi)進行擴增檢測。檢測結(jié)果：根據(jù)HPV亞型探針熒光標識表進行結(jié)果判斷，HPV亞型擴增曲線結(jié)果顯示典型S型曲線且CT值<參考值，表明HPV亞型為陽性；HPV亞型擴增曲線結(jié)果不顯示S型擴增曲線或CT值>參考值，表明HPV亞型為陰性。通過檢測宮頸脫落細胞內(nèi)單拷貝基因，測算樣本中的細胞數(shù)量，獲得HPV定量的基準，再報告同等細胞數(shù)量(10 000個細胞)內(nèi)的HPV病毒拷貝數(shù)，實現(xiàn)同步對21種HPV基因亞型進行基因分型及標準化定量。

本檢測將21種HPV亞型分為13種高危型(HPV16、52、58、18、31、33、35、39、45、51、56、59和68亞型)，5種中危型(26、53、66、73和82亞型)及3種低危型(HPV6、11和81亞型)，有≥2種HPV亞型合并感染者為多重感染，對多重感染者，各HPV亞型陽性率重復計算。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用n(%)表示，不同年齡組間檢出率差異采用用χ2檢驗，SPSS分析不同年齡段陽性檢出率差異有無統(tǒng)計學意義，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV感染狀況和基因型分布 2 195名女性中有420名感染HPV，總感染率為19.13%(420/2 195)。高危型HPV感染率14.90%(327/2 195)，其中高危型單一感染率為11.07%(243/2 195)，84例發(fā)生高危型多重感染，占高危型感染的25.69%(84/327)。低危型HPV感染率僅為3.51%(77/2 195)，其中低危型合并高危型感染率為1.46%(32/2 195)。感染率最高的HPV亞型為HPV52(3.83%)，排名第2的是HPV16(2.28%)和HPV58(2.28%)，第3是HPV39(1.64%)。

2.2各年齡段HPV感染陽性率比較 2 195名研究對象分成3個年齡段：<30歲556例(占25.33%)、30～54歲1 549例(占70.57%)、>54歲90例(占4.10%)。2 195例受試患者中，>54歲組HPV高危型的感染率為23.33%，30～54歲組為15.11%，<30歲組為12.95%。各年齡組間高危型感染陽性檢出率及HPV總陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而高危型單一感染率和高危型多重感染率差異卻無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 江蘇省蘇州西部地區(qū)婦女不同年齡段HPV感染檢出情況[n(%)]

2.3HPV亞型感染的病毒載量分布 420例HPV感染患者中，將HPV多重感染者在各HPV亞型感染中分別計數(shù)，故所得總例數(shù)是540例。HPV52，HPV16、HPV58和HPV39型感染者以中、低病毒載量為主，而HPV51型感染者以低病毒載量為主。見表2。

表2 HPV亞型感染的病毒載量分布(n)

續(xù)表2 HPV亞型感染的病毒載量分布(n)

注：a表示計量單位為拷貝數(shù)/104個細胞；低危型沒有列出；-表示此項無數(shù)據(jù)

3 討 論

本研究采用多重熒光PCR技術(shù)，高通量、自動化分管及閉管檢測21種HPV基因亞型，該項目是全球首個、也是目前唯一可以同步HPV分型及標準化定量的檢測技術(shù)。檢測HPV DNA靶標，分管區(qū)分18種高中危及3種低危型總計21種HPV基因型別，并同步報告各基因亞型的病毒拷貝數(shù)；另外，通過檢測宮頸脫落細胞內(nèi)獨特的單拷貝基因，還可以報告樣本中的采集的細胞數(shù)量，最終報告“單位數(shù)量細胞中不同HPV型別及其攜帶病毒載量”，從而實現(xiàn)同步HPV分型及標準化定量。中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院研究數(shù)據(jù)表明碩世HPV與測序法陽性一致性為100.0%，而傳統(tǒng)分型方法僅為59.1%[6]。

女性宮頸HPV感染與當?shù)亟?jīng)濟、衛(wèi)生水平有關(guān)，不同地區(qū)HPV感染率差異較大。本研究結(jié)果顯示，2 195名蘇州西部地區(qū)婦女的HPV感染率為19.13%，其中高危型HPV感染率為14.90%，與甘肅地區(qū)一致[7]，低于重慶地區(qū)[8]和石家莊地區(qū)[9]。HPV總感染率高于北京地區(qū)15.57%[10]和天津地區(qū)15.93%[11]。不同地區(qū)HPV感染的型別也存在較大差異，本研究發(fā)現(xiàn)蘇州西部地區(qū)婦女易感HPV型別為HPV52、HPV16、HPV58和HPV39。甘肅地區(qū)常見HPV感染基因亞型為HPV16，HPV58，HPV52，HPV18和HPV53型[7]。石家莊地區(qū)常見HPV感染基因亞型為HPV16，HPV58，HPV52，HPV6和HPV18型[9]。而天津地區(qū)HPV感染率比較高的亞型分別為HPV52，HPV16，HPV58，HPV56和HPV81型[11]。這些差異可能與風俗習慣、文化程度及生活方式等有關(guān)。

從各HPV亞型感染患者中不同級別病毒負荷量的分布來看，在HPV52，HPV16、HPV58和HPV39型感染者以中、低病毒載量為主，而HPV51型感染者以低病毒載量為主。高病毒載量與宮頸病變相關(guān)，因此蘇州西部地區(qū)女性HPV感染可以定期檢測和治療來預(yù)防早期宮頸病變。

女性的年齡是影響HPV感染的重要因素之一。本研究結(jié)果顯示，>54歲婦女高危型HPV的感染率為23.33%，30～54歲組為15.11%，<30歲組為12.95%。而石家莊地區(qū)與此相反，HPV感染的年齡主要集中在40歲以下，甚至25歲以下HPV感染率為最高[9]。而天津地區(qū)HPV感染的年齡主要集中在35～45歲[11]。

本研究主要圍繞蘇州西部地區(qū)女性感染HPV特點及其基因型分布展開，有望為研發(fā)適應(yīng)于本地區(qū)的HPV多價疫苗提供了重要的理論基礎(chǔ)。