梁 毅，寧思思，陳 曉

(廣西壯族自治區(qū)玉林市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西玉林 537000)

地中海貧血是一組由于珠蛋白基因的缺陷導(dǎo)致珠蛋白合成障礙所引起的常染色體隱性遺傳性溶血性疾病，其臨床表型可從無(wú)癥狀到致命的溶血性貧血[1]。中國(guó)南方為地中海貧血高發(fā)地區(qū)，特別是廣西當(dāng)?shù)厝巳旱刂泻Ｘ氀驍y帶率高達(dá)24.5%[2]。按照存在缺陷的珠蛋白基因的種類，地中海貧血一般可以分為α-、β-、δβ-和εγδβ-地中海貧血等類型，其中α-和β-地中海貧血最為常見[3]。目前該病尚無(wú)有效的治療方法，只能通過(guò)對(duì)婚檢、孕檢夫婦以及胎兒進(jìn)行準(zhǔn)確的地中海貧血基因診斷或產(chǎn)前診斷，來(lái)杜絕中、重型患兒的出生，從而降低出生缺陷的概率[2]。地中海貧血基因突變一般分為點(diǎn)突變及缺失突變。目前國(guó)內(nèi)地中海貧血基因診斷的常規(guī)檢測(cè)范圍為常見的3種缺失型α-地中海貧血、3種點(diǎn)突變型α-地中海貧血和17種點(diǎn)突變型β-地中海貧血，涵蓋了中國(guó)人群中95%以上的α-和β-地中海貧血致病基因缺陷，但仍有5%罕見或未知突變未能進(jìn)行檢測(cè)[4]。在研究及臨床工作中會(huì)發(fā)現(xiàn)一些基因型與表型不符或者與遺傳規(guī)律不符的結(jié)果，提示該基因型可能是罕見或未知的，如不做進(jìn)一步檢測(cè)，則有可能出現(xiàn)誤檢、漏檢等情況，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致重型地中海貧血患兒的出生。本文通過(guò)回顧性分析1例罕見重型β-地中海貧血的診斷及基因檢測(cè)過(guò)程，探討罕見地中海貧血的產(chǎn)前診斷策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦39歲，其丈夫，46歲，夫婦雙方均為廣西籍人。夫婦在縣級(jí)醫(yī)院檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)雙方的血液學(xué)表型均為紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)降低，且夫婦雙方的血紅蛋白電泳分析結(jié)果顯示血紅蛋白A2(HbA2)升高。該結(jié)果提示為小細(xì)胞低色素性貧血，夫婦遂到本院進(jìn)行進(jìn)一步的地中海貧血相關(guān)的檢查。孕婦常規(guī)地中海貧血基因診斷結(jié)果為α-和β-地中海貧血均存在突變。其丈夫的基因結(jié)果也為α-和β-地中海貧血均存在突變。夫婦同型β-地中海貧血，符合產(chǎn)前診斷指征。簽署產(chǎn)前診斷知情同意書后，孕婦于孕17+5周抽取羊水對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前地中海貧血基因檢測(cè)。

1.2標(biāo)本采集 受檢孕婦及其丈夫分別用真空抗凝采血管采集外周靜脈血3管，每管約3 mL，分別用于血常規(guī)分析、血紅蛋白電泳分析和地中海貧血基因分析。胎兒羊水標(biāo)本的采集是在超聲引導(dǎo)下，對(duì)受檢孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水15 mL左右，并分裝到2個(gè)15 mL的無(wú)菌離心管中，每管6～8 mL，其中1管直接進(jìn)行地中海貧血基因檢測(cè)，另1管則經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)后利用羊水貼壁細(xì)胞再進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.3血液學(xué)一般檢查 采用全自動(dòng)血液分析儀(購(gòu)自日本Sysmex公司，型號(hào)XE-5000)對(duì)受檢孕婦及其丈夫的靜脈血進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)；采用全自動(dòng)高壓毛細(xì)管電泳儀(購(gòu)自法國(guó)Sebia公司，型號(hào)Capillarys 2 Flex Piercing)按照儀器和配套試劑的操作說(shuō)明書對(duì)血紅蛋白電泳和定量進(jìn)行檢測(cè)、分析。

1.4標(biāo)本DNA提取 上述所采集的標(biāo)本均使用全血DNA(溶液型)核酸提取試劑盒(購(gòu)自中國(guó)深圳亞能生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行基因組DNA提??；用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)提取得到的DNA樣本的濃度及純度。要求提取的DNA樣本濃度≥20 ng/μL且純度A260/280=1.7～1.9。

1.5常見地中海貧血基因檢測(cè) 目前常見的3種缺失型α-地中海貧血為-SEA、-α3.7、-α4.2，常用多重跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Gap-PCR)方法來(lái)檢測(cè)。常見的3種點(diǎn)突變型α-地中海貧血(CS、QS、WS)和17種點(diǎn)突變型β-地中海貧血CD41-42、CD43、IVS-Ⅱ-654、-28、-29、-32、CD71-72、βE、CD17、CD31、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CAP+1、Int、-30)一般使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/反向點(diǎn)雜交法(RDB-PCR)來(lái)檢測(cè)[1,4]。采用相應(yīng)類型的地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自中國(guó)深圳亞能生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行常見地中海貧血的檢測(cè)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6β-珠蛋白基因序列檢測(cè) 吸取受檢孕婦及其丈夫的靜脈血1 mL分別置于1.5 mL的小型離心管中，將培養(yǎng)好的部分胎兒羊水貼壁細(xì)胞也置于1.5 mL的小型離心管中，做好標(biāo)記和說(shuō)明，然后寄送到中國(guó)深圳亞能生物技術(shù)有限公司進(jìn)行β-珠蛋白基因序列的測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 受檢孕婦及其丈夫的血常規(guī)和血紅蛋白電泳結(jié)果顯示，孕婦及其丈夫的MCV和MCH均減低，提示二者均可能有小細(xì)胞低色素性貧血。孕婦及其丈夫的血紅蛋白電泳結(jié)果顯示HbA2和HbF均升高。綜合分析二者的血液學(xué)結(jié)果，判斷為地中海貧血初篩陽(yáng)性。見表1。

表1 受檢孕婦及其丈夫血液學(xué)檢查結(jié)果

表2 受檢孕婦、其丈夫及胎兒的地中海貧血基因檢查結(jié)果

2.2常見地中海貧血基因的檢測(cè)結(jié)果 常見地中海貧血基因檢查結(jié)果表明，受檢孕婦發(fā)現(xiàn)基因型為-α4.2/αα、41-42M/βN，同時(shí)攜帶有α-和β-地中海貧血。其丈夫地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果為-α3.7/αα、-28M/βN，也是同時(shí)攜帶有α-和β-地中海貧血。胎兒發(fā)現(xiàn)基因型為αα/αα、41-42M/41-42M，從結(jié)果可以看出α-地中海貧血基因檢測(cè)無(wú)異常，存在β-地中海貧血，但是β-地中海貧血的基因型不符合遺傳學(xué)規(guī)律。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)上述三者的地中海貧血基因檢測(cè)了進(jìn)行復(fù)查，復(fù)查結(jié)果與第1次結(jié)果一致。受檢孕婦否認(rèn)非親子可能。為了尋找β-地中海貧血的基因型不符合遺傳學(xué)規(guī)律的原因，遂對(duì)三者的β-珠蛋白基因進(jìn)行了測(cè)序。見表2、圖1。

注：A表示正常對(duì)照；B表示受檢孕婦；C表示孕婦的丈夫；D表示胎兒(羊水)
圖1 β-地中海貧血RDB-PCR結(jié)果

2.3β-珠蛋白基因序列的檢測(cè)結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示，孕婦的β-珠蛋白基因存在CD41-42(-TTCT)突變雜合子，與常見地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果一致。其丈夫的β-珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果除了檢測(cè)到常見地中海貧血基因所檢測(cè)到的-28(A->G突變外，還發(fā)現(xiàn)了罕見的CD43(GAG→AAG)突變見。胎兒(羊水)的測(cè)序結(jié)果為同時(shí)存在CD41-42(-TTCT)突變和罕見的CD43(GAG→AAG)突變。胎兒的β-珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果符合遺傳學(xué)規(guī)律。見圖2。

注：A結(jié)果表示受檢孕婦；B、C結(jié)果表示孕婦的丈夫；D、E結(jié)果表示胎兒(羊水)；箭頭所指位點(diǎn)為突變位點(diǎn)
圖2 β-珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果

3 討 論

地中海貧血是世界上最常見的血紅蛋白病之一，其分子基礎(chǔ)較為復(fù)雜且突變類型繁多[3]。目前世界上α-珠蛋白基因突變多達(dá)300多種，中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)約22種，β-地中海貧血突變多達(dá)200多種，中國(guó)人群中已報(bào)道的約46種[5-6]。目前，常規(guī)的地中海貧血基因檢測(cè)只涵蓋了常見的3種缺失型和3種點(diǎn)突變型α-地中海貧血以及17種點(diǎn)突變型β-地中海貧血，無(wú)法檢測(cè)該范圍外的較為罕見或未知的地中海貧血類型。宋春林等[7]研究發(fā)現(xiàn)，用二代高通量測(cè)序方法檢測(cè)1 368例標(biāo)本，共發(fā)現(xiàn)523例陽(yáng)性結(jié)果，比常規(guī)方法多發(fā)現(xiàn)了25例，檢出率提高了4.81%。由此可見罕見及未知類型地中海貧血在地中海貧血中占有一定的比例，如不做進(jìn)一步檢測(cè)，則容易出現(xiàn)漏診、誤診，從而延誤產(chǎn)前診斷，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致重型地中海貧血患兒的出生。

在本研究中，前期發(fā)現(xiàn)受檢孕婦及其丈夫的血常規(guī)檢查結(jié)果均顯示為地中海貧血初篩，經(jīng)遺傳咨詢后雙方進(jìn)行了地中海貧血基因檢測(cè)。常見地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果顯示夫婦雙方均為地中海貧血攜帶者，且兩人有同型β-地中海貧血，符合產(chǎn)前診斷指征，因此抽取胎兒羊水進(jìn)行常見地中海貧血基因產(chǎn)前診斷。單從結(jié)果分析，胎兒基因型為αα/αα、41-42M/41-42M，為β-地中海貧血純合子突變，屬于重型地中海貧血。但結(jié)合孕婦及其丈夫的地中海貧血基因型分析后發(fā)現(xiàn)，胎兒的基因型不符合遺傳學(xué)規(guī)律。為了尋找導(dǎo)致這一現(xiàn)象的發(fā)生原因，筆者首先對(duì)所有檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了復(fù)查，復(fù)查基因型與第1次基因型一致，排除做錯(cuò)標(biāo)本的可能性。經(jīng)詢問(wèn)后，受檢孕婦否認(rèn)非親子可能。最后考慮是否為罕見地中海貧血影響了檢測(cè)。對(duì)三者的β-珠蛋白基因進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕婦的丈夫?yàn)棣?珠蛋白基因-28突變合并罕見的CD43(GAG→AAG)突變的雙重雜合子，胎兒遺傳了來(lái)自母親的β-珠蛋白基因41-42突變及父親的CD43(GAG→AAG)突變，也是雙重雜合子，結(jié)果符合遺傳學(xué)規(guī)律。β-珠蛋白基因CD43(GAG→AAG)突變是1種極為罕見的異常血紅蛋白突變，目前關(guān)于該突變的報(bào)道還比較少。2008年HOYER等[8]報(bào)道了在白種人群中發(fā)現(xiàn)了這一突變。直到2010年，莫桂玲等[9]在中國(guó)人群中首次發(fā)現(xiàn)了這種突變，ZHAO等[10]在2017年也在中國(guó)人群中檢測(cè)到了該突變。這種突變是導(dǎo)致常規(guī)檢測(cè)所得結(jié)果不符合遺傳學(xué)規(guī)律重要原因，因?yàn)樵撏蛔儎偤迷讦履l上41-42N探針?biāo)采w的范圍附近，導(dǎo)致41-42N探針雜交不上去，最終導(dǎo)致β膜產(chǎn)品41-42N位點(diǎn)不顯色，結(jié)果判讀時(shí)便被判讀為41-42M/41-42M純合子。由此可見，有些罕見地中海貧血的存在可能會(huì)影響到常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè)的結(jié)果，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致誤診。這也提示在進(jìn)行胎兒地中海貧血基因產(chǎn)前診斷時(shí)，需結(jié)合其父母的地中海貧血基因結(jié)果聯(lián)合判斷。同時(shí)也提示當(dāng)常規(guī)基因檢測(cè)結(jié)果與臨床表型不吻合時(shí)，應(yīng)考慮該結(jié)果是否含有罕見或未知的地中海貧血類型，當(dāng)與遺傳規(guī)律不符的結(jié)果時(shí)，也應(yīng)考慮該結(jié)果是否含有罕見或未知的地中海貧血類型。

綜上所述，建議地中海貧血產(chǎn)前診斷的診斷策略：首先應(yīng)嚴(yán)格按照地中海貧血篩查到診斷的步驟對(duì)可疑的夫婦進(jìn)行檢查，胎兒的地中海貧血基因檢查結(jié)果應(yīng)結(jié)合其父母的基因結(jié)果綜合分析。特別是存在父母一方存在檢測(cè)結(jié)果與臨床表型不吻合的情況或胎兒結(jié)果不符合遺傳學(xué)規(guī)律時(shí)，需應(yīng)用基因測(cè)序等方法進(jìn)一步檢測(cè)，聯(lián)合應(yīng)用多種方法進(jìn)行確診，避免漏診、誤診，從而避免重型地中海貧血患兒的出生。這對(duì)減緩社會(huì)壓力和實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。