劉 玲，陳 敏，黃恒柳，何建維，杜金艷，唱 凱，皮 燕

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.檢驗(yàn)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400042)

華法令是目前臨床廣泛使用的香豆素類(lèi)口服抗凝藥物，主要應(yīng)用于深靜脈血栓、肺栓塞、心房顫動(dòng)、左心室血栓等疾病的治療[1]。路航等[2]對(duì)2014年房顫指南解讀中提及，據(jù)GLORIATM-AF登記的全球性研究數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)患者華法令使用率最低，僅為20.3%，歐洲高達(dá)63.9%。大量國(guó)內(nèi)外研究表明[3-6]，細(xì)胞色素P450超家族(CYP)中的CYP2C9，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VKORC1)的基因多態(tài)性與華法令用藥劑量的個(gè)體差異密切相關(guān)。

目前研究表明，華法令治療窗窄，不同民族、個(gè)體間使用劑量存在明顯差異[7]。臨床上超劑量用藥有出血風(fēng)險(xiǎn)，而華法令用藥劑量不足將導(dǎo)致血栓形成。遺傳因素是影響華法令用藥的根本因素，而遺傳因素中影響華法令劑量及代謝最主要的是VKORC1、CYP2C9基因多態(tài)性，可解釋高達(dá)40%～60%華法令劑量個(gè)體差異[8-10]。本文就重慶地區(qū)人群CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的分布進(jìn)行研究，旨在為重慶地區(qū)華法令用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年2月至2018年12月陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)了CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的患者657例，其中男357例，女300例，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集外周血2～3 mL。所有患者為無(wú)血緣關(guān)系的重慶漢族人。

1.2儀器與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自中國(guó)北京天根有限公司)；CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒、生物芯片雜交儀、生物芯片識(shí)讀儀均購(gòu)自中國(guó)上海百傲有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集患者外周血2～3 mL，充分混勻，及時(shí)送分子室檢測(cè)。

1.3.2DNA提取 靜脈血按照全血DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取DNA。DNA樣品-20 ℃保存，反復(fù)凍融不超過(guò)3次。

1.3.3PCR擴(kuò)增 取出提前分裝好的CYP2C9和VKORC1擴(kuò)增液，擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：CYP2C9和VKORC1擴(kuò)增液22 μL、反應(yīng)液1 μL、DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物于2～8 ℃保存。

1.3.4雜交顯色 (1)雜交試劑準(zhǔn)備：按照說(shuō)明書(shū)配制雜交反應(yīng)液、抗體使用液，加入試管架對(duì)應(yīng)孔內(nèi)。(2)CYP2C9和VKORC1基因芯片做好標(biāo)記，放入雜交儀片架中。(3)雜交反應(yīng)液中加入10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻，將試管架放入雜交儀，運(yùn)行雜交程序。(4)取出芯片，放入生物芯片識(shí)讀儀中，用百傲基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，輸出檢測(cè)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用頻數(shù)計(jì)數(shù)法計(jì)算各基因型及等位基因頻率，用χ2檢驗(yàn)比較基因型多態(tài)性在不同性別及疾病人群間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CYP2C9和VKORC1基因型檢測(cè) CYP2C9和VKORC1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)基因芯片分析后的基因型生物芯片識(shí)別圖，見(jiàn)圖1。

注：A表示*1/*1 AA；B表示*1/*1 GA；C表示*1/*3 AA
圖1 CYP2C9和VKORC1基因芯片檢測(cè)結(jié)果

2.2CYP2C9和VKORC1基因型頻率及等位基因頻率 本研究中*1/*1型594例(90.41%)，*1/*2型3例(0.46%)，CYP2C9*1/*3型60例(9.13%)，其中*1等位基因頻率為95.21%，*2等位基因頻率為0.23%，*3等位基因頻率為4.56%。AA型542例(82.50%)，GA型112例(17.04%)，GG型3例(0.46%)，其中A等位基因頻率為91.02%，G等位基因頻率為8.98%。各基因型及等位基因分布在男女之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3不同基因型人群的華法令使用劑量 本研究中檢測(cè)出8種基因型：*1/*1 AA型483例(73.52%)，*1/*1 GA型106例(16.13%)，*1/*1 GG型3例(0.46%)，*1/*2 AA型1例(0.15%)，*1/*2 GA型1例(0.15%)，*1/*3 AA型57例(8.68%)，*1/*3 GA型5例(0.76%)，*1/*3 GG型1例(0.15%)，未檢測(cè)出*1/*2 GG型。各基因型分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中需要使用高劑量華法令(5.0～7.0 mg)占16.59%，中等劑量(3.0～4.0 mg)占74.73%，低劑量(0.5～2.0 mg)占8.68%。見(jiàn)表2。

表1 CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性分布(n)

表2 不同CYP2C9和VKORC1基因型人群的分布及FDA推薦華法令使用劑量[n(%)]

注：a表示華法令高度敏感型，使用劑量為0.5～2.0 mg；b表示華法令敏感型,使用劑量為3.0～4.0 mg；c表示華法令不敏感型，使用劑量為5.0～7.0 mg

2.4CYP2C9和VKORC1各基因型分布在不同疾病患者間的比較 本研究收集冠心病患者376例、房顫患者117例、支架術(shù)后患者28例、靜脈血栓患者26例、其他心血管疾病患者93例、其他17例，其中冠心病患者最多。共檢測(cè)出8種基因型，其中*1/*1 AA型最多。各基因型分布在不同疾病患者間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同疾病患者CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性比較(n)

3 討 論

華法令是由R-和S-對(duì)映體組成的外消旋混合物，起抗凝作用的主要是S-華法令，有研究表明，S-華法令抗凝作用比R-華法令高3～5倍[11]。細(xì)胞色素CYP2C9是一類(lèi)主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，華法令在肝臟中經(jīng)CYP2C9代謝為非活性產(chǎn)物。CYP2C9基因位于染色體10q24.2，全長(zhǎng)約55 kb[12]。目前已發(fā)現(xiàn)多種突變等位基因，其中以CYP2C9*2和CYP2C9*3突變型最為常見(jiàn)。CYP2C9基因突變導(dǎo)致酶活性降低，機(jī)體對(duì)華法令代謝減緩，華法令在體內(nèi)堆積，出血風(fēng)險(xiǎn)增加，因此CYP2C9基因突變者華法令劑量應(yīng)減少。VKORC1為維生素K循環(huán)中1個(gè)關(guān)鍵酶，可抑制依賴(lài)維生素K凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性，華法令通過(guò)抑制VKORC1發(fā)揮抗凝作用。VKORC1基因位于染色體16p11.2，全長(zhǎng)約11 kb[12]。VKORC1存在基因多態(tài)性，尤其是-1639G>A，VKORC1基因突變后會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，對(duì)華法令敏感程度增強(qiáng)，出血風(fēng)險(xiǎn)增加，故VKORC1基因突變者華法令使用劑量也應(yīng)減少。

本研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1型和AA型為主，頻率分別為90.41%、82.50%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)漢族人群CYP2C9、VKORC1多態(tài)性一致[13]。CYP2C9基因突變?cè)谀信g差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[14]。本研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)使用高劑量華法令(5.0～7.0 mg)比例為16.59%，中等劑量(3.0～4.0 mg)比例為74.73%，低劑量(0.5～2.0 mg)比例為8.68%。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，個(gè)體化用藥已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)，CYP2C9、VKORC1基因檢測(cè)開(kāi)始受臨床醫(yī)生重視，但大多數(shù)醫(yī)生使用華法令抗凝依舊采用經(jīng)驗(yàn)劑量給藥，對(duì)本該需要使用高劑量華法令抗凝患者使用普通劑量華法令，抗凝效果減弱，甚至有出血風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)華法令低劑量基因型患者使用普通劑量華法令，則可能導(dǎo)致抗凝過(guò)度，甚至出現(xiàn)血栓。研究表明，與未進(jìn)行基因檢測(cè)患者相比，根據(jù)CYP2C9和VKORC1基因檢測(cè)結(jié)果用藥的患者出血及血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低29%，總住院率減少31%[15]。

4 結(jié) 論

重慶地區(qū)CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1 AA為主，人群以華法令敏感型為主，敏感型人群建議華法令起始劑量3.0～4.0 mg。華法令用藥前建議進(jìn)行CYP2C9和VKORC1基因檢測(cè)從而提高華法令使用的安全性及有效性。