張 舒 王長遠(yuǎn) 譚朝印 馮玉超

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

綠豆屬于豆科類，又名青小豆、植豆等[1]，在東亞各國廣泛種植。2015年11月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出適時(shí)發(fā)展雜糧雜豆等經(jīng)濟(jì)作物，為中國綠豆的發(fā)展提供了更好的前景[2]。綠豆中含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、鈣及多種礦物質(zhì)元素，其中蛋白質(zhì)含量為24%左右[3]，是制備優(yōu)質(zhì)蛋白的良好原材料[4]。綠豆是眾多豆類中蛋白質(zhì)含量比較豐富的一種，含有的氨基酸種類齊全，如異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等必須氨基酸，并且蛋白質(zhì)的功效極好[5]，其中綠豆清蛋白具有優(yōu)良的溶解性、持水性、乳化性等，在食品工業(yè)中發(fā)揮著重要作用[6-7]。

綠豆的應(yīng)用大多還停留在傳統(tǒng)的模式上，近年來才逐漸重視并加大對(duì)綠豆的使用和研究。并且大部分研究集中于綠豆總蛋白及其功能性質(zhì)[8-9]，加工后綠豆蛋白的結(jié)構(gòu)功能性質(zhì)的改變[10-11]，以及對(duì)綠豆分級(jí)蛋白含量和功能性質(zhì)[12]方面，但對(duì)于綠豆清蛋白的提取工藝優(yōu)化并不多，且提取時(shí)間較長[13] 22。因此試驗(yàn)擬采用Osborne分級(jí)法，從綠豆中提取清蛋白，研究料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)清蛋白提取率的影響，并分析綠豆清蛋白亞基組成，為綠豆清蛋白結(jié)構(gòu)研究及精深加工提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

綠豆：市售；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；

SDS-PAGE凝膠試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；

蛋白Marker(SM0431)，北京索萊寶科技有限公司；

考馬斯亮藍(lán)(G250)：天津市科密歐化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器

精密pH計(jì)：DELTA 320型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

凱氏定氮儀：SKDA-800型，上海沛歐分析儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：Alpha 1-2 LD plus型，德國CHRISTA公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：A360型，翱藝儀器(上海)有限公司；

電泳儀：Mini-Protean 4型，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠豆清蛋白的提取工藝 精選綠豆除雜后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，制成綠豆粉樣品。綠豆粉和石油醚以1∶5(g/mL)的液料比在室溫下每次均勻攪拌5 h，進(jìn)行2～3次脫脂處理后，得到脫脂綠豆粉。采用Osborne分級(jí)法的第一步，將100 g脫脂綠豆粉與蒸餾水按一定比例混合后，在適合的水浴溫度下進(jìn)行攪拌一段時(shí)間后，在4 000 r/min的條件下離心20 min，調(diào)節(jié)所取上清液的pH值至綠豆清蛋白等電點(diǎn)，使蛋白沉淀，靜止30 min后以同樣轉(zhuǎn)速離心20 min，取沉淀，使其在真空度0.03～0.08 kPa、-50 ℃的參數(shù)下冷凍干燥，并于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 料液比：稱取80 g脫脂綠豆粉樣品放置在燒杯中，加入不同比例的水，設(shè)置水浴的提取溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為120 min。提取完成后用臺(tái)式低速離心機(jī)離心樣液，取上清液做樣品測(cè)定，于650 nm下測(cè)樣品的吸光度，計(jì)算提取率。

(2) 提取溫度：稱取80 g脫脂綠豆粉，加入蒸餾水的比例為1∶10 (g/mL)，在30～50 ℃的水浴溫度中攪拌加熱120 min，溫度梯度間距設(shè)定為5 ℃。提取完成后用臺(tái)式低速離心機(jī)離心樣液，取上清液進(jìn)行濃度測(cè)定，測(cè)量吸光度，計(jì)算提取率。

(3) 提取時(shí)間：稱取80 g脫脂綠豆粉，豆粉與蒸餾水的比例為1∶10 (g/mL)，在水浴溫度為40 ℃的水浴鍋中水浴加熱60～180 min，時(shí)間梯度間距設(shè)定為30 min。提取完成后離心樣液，取上清液進(jìn)行濃度測(cè)定，測(cè)量吸光度，計(jì)算提取率。

1.3.3 正交試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以綠豆清蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.3.4 提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用福林酚法。

(1) 堿性銅溶液配置：稱取2.500 g NaOH、12.500 g Na2CO3，溶于100 mL蒸餾水中，備用。稱取0.125 g酒石酸鉀溶于12.5 mL蒸餾水中，準(zhǔn)確稱取0.062 5 g硫酸銅溶于7.5 mL蒸餾水中，備用(使用前合并配置的溶液)。

(2) 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用賀建華等[14]的試驗(yàn)方法，用牛血清蛋白(250 μg/mL)分別配置0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL的牛血清蛋白溶液，各取1.0 mL試液放置在試管(25 mL)中，標(biāo)號(hào)0～6，取1.0 mL 堿性銅溶液和4.0 mL福林酚試液于各試管中，搖勻。于55 ℃水浴中放置5 min，后再于冷水中放置10 min，反應(yīng)結(jié)束后以0號(hào)試管為空白對(duì)照測(cè)吸光度(650 nm)。

(3) 樣品的測(cè)定：取一支試管加入1.0 mL樣品溶液、1.0 mL堿性銅溶液和4.0 mL福林酚試液，快速混勻。于55 ℃水浴中放置5 min，再于冷水中放置10 min，測(cè)吸光度(650 nm)。

1.3.5 清蛋白提取率的測(cè)定 根據(jù)1.3.1的提取方法冷凍干燥獲得清蛋白后，將其復(fù)溶于一定量的蒸餾水中采用上述方法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，按式(1)計(jì)算清蛋白的提取率。

(1)

式中：

Y——清蛋白提取率，%；

c——提取液蛋白質(zhì)濃度，g/mL；

v——提取液體積，mL；

m1——樣品蛋白質(zhì)含量，g。

m2——樣品取樣量，g。

1.3.6 等電點(diǎn)的測(cè)定 測(cè)定調(diào)節(jié)pH后的上清液濃度，根據(jù)等電點(diǎn)處溶解性最低的原理以濃度最低值即吸光度值最小為綠豆清蛋白等電點(diǎn)。

1.3.7 蛋白純度的測(cè)定 采用凱氏定氮法。參考李永武[13] 20的方法，并選擇適當(dāng)條件進(jìn)行測(cè)定：稱取1 g蛋白質(zhì)樣品于錐形瓶內(nèi)，加0.5 g Cu2SO4、10 g KSO4和20 mL濃硫酸，搖勻后加熱使瓶內(nèi)液體持續(xù)輕微沸騰。當(dāng)溶液的顏色變?yōu)榍宄旱乃{(lán)綠色溶液后，恒溫處理30 min后冷卻，于100 mL容量瓶中定容備用。樣品冷卻后使用半自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾，蒸餾結(jié)束后用0.01 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，當(dāng)溶液的顏色變?yōu)槲⒓t色時(shí)停止滴定，并記錄所用鹽酸的量。按式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)

式中：

W——蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V1——空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；

V2——試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量；

F——蛋白質(zhì)系數(shù)。

1.3.8 綠豆清蛋白SDS-PAGE電泳分析 將提取的綠豆蛋白質(zhì)溶解，配制濃度為0.5 mg/mL的蛋白溶液，加入等量的上樣緩沖液(0.25 mol/L Tris-HCl，10% SDS，0.5% 溴酚藍(lán)，50% 甘油，5%β-疏基乙醇)，于沸水浴中加熱5 min。配制濃度分別為12%，5%的分離膠和濃縮膠，電泳上樣量10 μL。樣品冷卻后，設(shè)定電壓80 V，開始電泳，當(dāng)條帶至分離膠低端處時(shí)電泳結(jié)束。使用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，染色完成后使用洗脫液脫色。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.727 4x-0.002 8，決定系數(shù)R2=0.998 9。結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 等電點(diǎn)的測(cè)定

由圖2可知，pH為4.5時(shí)，吸光度值最低，此時(shí)蛋白沉淀量最高，故以此pH值為綠豆清蛋白的等電點(diǎn)。

圖2 不同pH值條件下的綠豆清蛋白溶液吸光度值

2.3 提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 料液比的影響 由圖3可知，在料液比為1∶6～1∶10 (g/mL)時(shí)提取率呈上升趨勢(shì)，可能是蛋白質(zhì)隨溶劑的增加而逐漸溶解出來，提取率上升[15]；當(dāng)料液比超過1∶10 (g/mL)后提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是水量過多導(dǎo)致酸沉?xí)r上清液中清蛋白的溶解量變大，造成蛋白損失，提取率下降[16]。選用3個(gè)提取率最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的料液比值作為正交因素水平，即1∶8，1∶10，1∶12(g/mL)。

圖3 料液比值與綠豆清蛋白提取率關(guān)系圖

Figure 3 Relationship between ratio of material to liquid and extraction rate of mung bean albumin

2.3.2 提取溫度的影響 由圖4可知，溫度為30～40 ℃時(shí)，提取率逐漸升高，可能是溫度升高，蛋白質(zhì)鏈展開，蛋白質(zhì)逐漸被溶解；溫度高于40 ℃時(shí)，提取率隨溫度升高而逐漸降低，可能是清蛋白對(duì)高溫較敏感，當(dāng)溫度升至某值時(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能溶出[17]。同上選用35，40，45 ℃。

2.3.3 提取時(shí)間的影響 由圖5可知，提取時(shí)間為1.0～2.5 h時(shí)，提取率隨時(shí)間變化而變高；當(dāng)提取時(shí)間超過2.5 h 后，提取率逐漸下降，可能是綠豆粉中水溶性清蛋白已經(jīng)大部分溶出，但因提取時(shí)間較長而使得之前被溶解出來的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化所致[18]。故選取1.5，2.0，2.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取溫度與綠豆清蛋白提取率關(guān)系圖

圖5 提取時(shí)間與綠豆清蛋白提取率關(guān)系圖

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化 正交試驗(yàn)因素水平取值見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，對(duì)綠豆清蛋白提取率的影響程度為：提取溫度>料液比>提取時(shí)間；最佳提取組合為料液比1∶10(g/mL)、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間150 min。由正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)方案，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)(重復(fù)3次)，最終提取率為(86.79±0.31)%。同比與其他雜豆中清蛋白的提取率如:李秋杰等[19]的大豆清蛋白提取率(66.41%)、陳曉萌[20]的紅蕓豆清蛋白提取率(66.81%)、訾艷等[21]的白蕓豆清蛋白提取率(37.93%)，試驗(yàn)對(duì)綠豆清蛋白的提取率顯著高于其他雜豆。同種原料相比結(jié)果略高于李永武[13] 31對(duì)綠豆清蛋白的提取率(86.71%)，盡管優(yōu)化后提取率的增長幅度不高，但一定程度上縮短了提取時(shí)間，減少了能源的浪費(fèi)，說明試驗(yàn)工藝優(yōu)化效果較好。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用凱氏定氮法對(duì)提取出的綠豆清蛋白進(jìn)行蛋白純度的測(cè)定，3個(gè)平行樣的蛋白純度分別為85%，89%，91%，平均值為88.33%。

2.4 SPS-PAGE電泳分析

由圖6可知，綠豆清蛋白主要由4條亞基條帶組成(Ⅱ～Ⅴ)，分子量分別為56.2，46.8，26.3，21.9 kD，第Ⅲ條帶的顏色較濃，表明綠豆清蛋白混合體中主要蛋白的分子量集中在46.8 kD左右，與趙天瑤等[22]對(duì)綠豆清蛋白的研究結(jié)果一致?？偟鞍椎臈l帶有5條亞基條帶(Ⅰ～Ⅴ)，分子量分別為67.6，54.9，43.7，33.9，22.9 kD，清蛋白的Ⅳ、Ⅴ亞基條帶分子量略小于總蛋白的亞基條帶。李永武[13]45對(duì)綠豆清蛋白研究發(fā)現(xiàn)有6條亞基條帶，曾志紅等[23]對(duì)不同品種的綠豆進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)綠豆的總蛋白的亞基條帶及其分子量與試驗(yàn)結(jié)果一致，但河南毛綠豆的總蛋白具有6條亞基條帶，多了一條分子質(zhì)量為39.5 kD 的亞基條帶。因此不同品種綠豆的清蛋白和總蛋白亞基之間存在差異。

M. 蛋白Marker 1. 綠豆清蛋白 2. 綠豆總蛋白

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)Osborne分級(jí)法提取綠豆清蛋白的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出綠豆清蛋白的最佳提取工藝為：料液比1∶10 (g/mL)、提取溫度45 ℃、水浴提取時(shí)間2.5 h，該條件下綠豆清蛋白的提取率為(86.79±0.31)%，純度為88.33%。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，清蛋白具有4條亞基條帶，分子量分別為56.2，46.8，26.3，21.9 kD。

試驗(yàn)僅探究了料液比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)基礎(chǔ)因素對(duì)綠豆清蛋白提取及亞基組成的影響，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討輔助提取因素對(duì)提取率及清蛋白結(jié)構(gòu)的影響。