常蘭蘭，仲玉備，王少博，陳樹興

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽,471023)

在歐美國家，山羊奶被視為奶中精品，國際學(xué)界譽其為“奶中之王”[1]。我國山羊奶資源豐富，并且具有較多優(yōu)點，例如脂肪球直徑小，能夠增強鐵、鈣的吸收，特別適合老年人、高血壓人群、嬰幼兒飲用。以山羊奶為原料制得的干酪，脂肪含量適中，組織結(jié)構(gòu)細(xì)膩，脂肪球、酪蛋白顆粒較小，感官評分較高[2]。綠豆是我國藥食兼用的食材，人體必須氨基酸含量達(dá)6.9%，蛋白質(zhì)含量高達(dá)24.7%，其清熱解毒、增進(jìn)食欲、抗過敏[3]、瀉火等功效為大家所知[4]。

有報道稱，陳雪等[5]研究5種發(fā)酵劑在干酪成熟過程中對其質(zhì)構(gòu)、感官、風(fēng)味物質(zhì)形成及蛋白水解程度等方面的影響，確定了干酪發(fā)酵劑菌株；賈魯彥等[6]通過向牛奶添加綠豆，成功制作出具有口感細(xì)膩、風(fēng)味清香淡雅具有清熱解毒功效的酸奶；祝敏等[7]研究了大豆分離蛋白對干酪風(fēng)味物質(zhì)的影響，最終確定大豆分離蛋白的添加比例及期望風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生；常有報道稱綠豆被用來加入到山羊奶中制成綠豆酸奶[8]，目前，對于將綠豆粉加入山羊奶中制作切達(dá)干酪缺乏系統(tǒng)的研究。

本研究通過向山羊奶中添加一定質(zhì)量的綠豆粉，采用四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化出最佳生產(chǎn)工藝，最終制作出口感細(xì)膩，且具有山羊奶、綠豆粉特有風(fēng)味的干酪。選用添加綠豆粉部分代替山羊奶，在制備綠豆粉山羊奶干酪的過程中，乳成分的改變可能會引起酪蛋白膠束的膠體狀態(tài)，為了分析添加綠豆粉對制得的干酪熱力學(xué)變化的影響，在其成熟期間對其差示量熱掃描(DSC)。綠豆粉為豆科植物綠豆的種子加工而成，每100 g綠豆粉中含蛋白質(zhì)22.1 g，由于其中某些酶的作用可能會引起山羊奶干酪中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，運用傅里葉紅外(FTIR)對山羊奶干酪中蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，為山羊奶干酪系列產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山羊奶購于河南省洛陽市吉利區(qū)綠色牧場，選取的山羊奶是略帶微黃色的均勻膠體，無黏稠、濃厚及分層等異?，F(xiàn)象出現(xiàn)；不得有肉眼可見的機(jī)械雜質(zhì)；具備山羊奶的正常氣味，不得有苦、咸、澀、臭等異味[9]的正常生鮮山羊奶，放置-4 ℃冰箱冷藏備用。

綠豆購于河南洛陽市洛龍區(qū)學(xué)子街丹尼斯超市，選取顆粒飽滿、均一、表面光滑，沒有皺縮，無霉變的東北綠豆，用自來水清洗3次，瀝干，微波加熱直至綠豆顆粒熟透，置于高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，并過200目篩后備用。發(fā)酵劑為干酪專用發(fā)酵劑，凝乳酶為小牛皺胃酶。無水醋酸鈉，CaCl2，CuSO4，K2SO4，H2SO4等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UL80BC實驗型干酪機(jī)，杭州優(yōu)創(chuàng)科技有限公司；全自動凱氏定氮儀，上海迅博科學(xué)儀器公司；高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3型pH計，上海億峰科學(xué)儀器有限公司;差示量熱掃描儀，蘇州雅程設(shè)備公司；中紅外光譜儀，天津港東科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆粉山羊奶切達(dá)干酪加工工藝流程

新鮮山羊奶→過濾→添加綠豆粉→巴氏殺菌→自然冷卻31 ℃[10]→添加發(fā)酵劑→攪拌5 min→添加CaCl2→凝乳50 min→調(diào)整pH值到6.12→添加凝乳酶→凝乳30 min→切割→攪拌→靜置25 min→升溫到41 ℃→排乳清→加食鹽(2%)→壓榨成型→成熟。

1.3.2 綠豆粉山羊奶干酪水分含量的測定

將干酪切成2 cm×2 cm×2 cm的正方體，放置于100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，干燥1 h，取出，置干燥器中，室溫放置20 min，精密稱定，直至2次稱量結(jié)果相差0.1 mg以下達(dá)到恒重[11]。

1.3.3 綠豆粉山羊奶干酪出品率的測定

(1)

式中：W1，綠豆粉山羊奶干酪的質(zhì)量，g；W0，原料山羊奶的質(zhì)量，g。

(考慮到每個試驗組干酪含水量的差異，將實測出品率校正到水分含量為45%的出品率[12])

校正出品率/%=

(2)

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

分別以發(fā)酵劑的添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、CaCl2的添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)、凝乳酶的添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)、綠豆粉的添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%)4個因素，每個因素設(shè)置5個水平，每個水平重復(fù)3次，以綠豆粉山羊奶干酪的出品率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗。

1.3.5 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化綠豆粉山羊奶干酪的制備工藝X1、X2、X3、X4

在單因素的試驗的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵劑添加量(X1)、CaCl2添加量(X2)、凝乳酶的添加量(X3)、綠豆粉的添加量(X4)4個因素進(jìn)行四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，因素水平見表1。

表1 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in second-order rotation combination experimental design

1.3.6 差示量熱掃描(DSC)的測定

干酪放置于坩堝內(nèi)，對其進(jìn)行壓樣密封，DSC測定條件設(shè)定為[14-16]：30 ℃保持10 min，以3 ℃/min升溫至120 ℃，用N2作為保護(hù)氣。

1.3.7 傅里葉紅外光譜測定

將干酪與KBr以1∶100的質(zhì)量比，放入瑪瑙研缽中進(jìn)行充分的研磨后，壓力確定為12 MPa，時間為1 min，壓出規(guī)則樣片，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測定，其中光譜選擇范圍為：500～4 000 cm-1[17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析采用DPS 7.5軟件分析，圖采用Origin 8.5軟件繪制，利用Design Expert 8.05b進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

發(fā)酵劑的添加量、CaCl2添加量、凝乳酶添加量、綠豆粉添加量對出品率的影響如圖1～圖4所示。

圖1 發(fā)酵劑的添加量對出品率的影響Fig.1 The effect of the amount of starter on the yield

由圖1可知，發(fā)酵劑的添加量在0.8%～1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，干酪出品率隨著發(fā)酵劑添加量的增加逐漸增大，呈現(xiàn)直線上升，在此范圍內(nèi)產(chǎn)品具有合適的酸度，口感溫和、香醇，且感官評分較高，發(fā)酵劑添加量確定為0.8%～1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

由圖2可知，隨著CaCl2添加量的增加，出品率逐漸增加，CaCl2的添加量在0.03%～0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，干酪綠豆味與奶香味組合恰當(dāng)，CaCl2的添加對干酪的凝乳具有較大的影響，CaCl2添加量較小時，干酪的凝乳效果較差，使得出品率很低，因此CaCl2添加量確定為0.03%～0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖2 CaCl2的添加量對出品率的影響Fig.2 The effect of CaCl2 addition on the yield

由圖3可知，隨著凝乳酶添加量的增加，出品率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)凝乳酶的添加量在0.03%～0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))出品率較優(yōu)，在此范圍內(nèi)，干酪凝乳時間縮短，乳清析出較快，致使干酪質(zhì)地細(xì)膩，組織狀態(tài)均一，出品率較高，因此凝乳酶添加量確定為0.03%～0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖3 凝乳酶的添加量對出品率的影響Fig.3 The effect of the amount of rennet on the yield

由圖4可知當(dāng)綠豆粉的添加量在0.6%～1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時制備出的干酪含水率較低，出品率呈現(xiàn)較高水平，且干酪山羊奶香味較濃，無明顯綠豆腥味，因此確定綠豆粉添加量為0.6%～1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖4 綠豆粉的添加量對出品率的影響Fig.4 The effect of the addition of mung bean powder on the yield

2.2 制備綠豆粉山羊奶干酪的四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果

采用DPS 7.5數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計了4因素5水平全實施的一共31組試驗點的通用旋轉(zhuǎn)組合試驗，以綠豆粉山羊奶干酪出品率(Y)為指標(biāo)，試驗方案及結(jié)果如表2所示。

表2 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果Table 2 Factors and levels used in second-order rotation combination experimental design with experimental results

經(jīng)回歸擬合后，得到綠豆粉山羊奶干酪的出品率(Y)對發(fā)酵劑添加量(X1)、CaCl2的添加量(X2)、凝乳酶的添加量(X3)、綠豆粉的添加量(X4)的二次多項式回歸方程為：

2.2.1 建立模型與顯著性檢驗

對二次回歸方程進(jìn)行F檢驗及失擬檢驗，結(jié)果表明：F2=9.23，p=0.000 1<0.01，極其顯著，R2=0.89；失擬檢驗F1=2.09，p=0.091>0.05，不顯著，表明回歸方程和實際情況擬合較好。因此該模型是合適的，可用于研究制備綠豆粉山羊奶干酪出品率的分析。

表3 試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model equation

注：當(dāng)p<0.01時，差異極顯著；p<0.05，差異顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

從交互作用及研究意義考慮，選擇發(fā)酵劑的添加量(X1)及綠豆粉的添加量(X4)進(jìn)行響應(yīng)面分析，將另外2個因素固定在0水平上[18]，采用Design Expert 8.05b 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，觀察發(fā)酵劑的添加量、綠豆粉的添加量2個因素的交互作用。繪制響應(yīng)面以及等高線圖，并進(jìn)行試驗因素對制備綠豆粉山羊奶干酪出品率影響的兩兩交互作用的進(jìn)行評價，同時確定各個因素的最優(yōu)選擇范圍。由圖5可知，響應(yīng)面坡度陡峭，說明發(fā)酵劑的添加量(X1)、綠豆粉的添加量(X4)對制備綠豆粉山羊奶切達(dá)干酪出品率的影響均較大。由響應(yīng)面的等高線圖可知，發(fā)酵劑的添加量1.00%～1.10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、綠豆粉的添加量0.9%～1.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時干酪出品率較高。同表3的顯著性分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的等高線圖呈現(xiàn)出橢圓形，表明兩者交互作用極顯著。發(fā)酵劑的添加量(X1)和綠豆粉的添加量(X4)交互作用顯著可能是因為發(fā)酵劑影響干酪的凝乳時間，綠豆粉的添加影響著干酪的含水率，最終導(dǎo)致發(fā)酵劑的添加量和綠豆粉的添加量對綠豆粉山羊奶干酪的出品率產(chǎn)生交互影響。

圖5 發(fā)酵劑的添加量和綠豆粉添加量對制備綠豆粉山羊奶干酪出品率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots for the effects of mung bean powder addition and starter addition addition on the yield of mung bean powder goat cheese

2.2.3 驗證試驗

運用2個指標(biāo)的試驗結(jié)果采用加權(quán)綜合評分法及多元回歸分析，設(shè)定2個指標(biāo)的加權(quán)值wj均為0.5，消除兩個指標(biāo)的量綱，計算加權(quán)綜合評分值，以加權(quán)綜合評分值為指標(biāo)再按照單指標(biāo)進(jìn)行極差分析，得到制備綠豆粉山羊奶干酪的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為：發(fā)酵劑添加量1.002 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、CaCl2的添加量0.035 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、凝乳酶的添加量0.044 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、綠豆粉的添加量0.897 9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。根據(jù)實際操作的可行性分析，將最佳制備條件修正為發(fā)酵劑添加量1.000%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、CaCl2的添加量0.035%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、凝乳酶的添加量0.045%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、綠豆粉的添加量0.900%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。修正后的最佳條件運用響應(yīng)面模型計算，得到指標(biāo)的值為：出品率10.30%。根據(jù)修正后的最佳工藝條件，進(jìn)行5次重復(fù)試驗，每個試驗做3個平行，測得干酪出品率的均值為(9.64±0.21)%，與理論預(yù)測值的誤差絕對值低于3%，經(jīng)t檢驗結(jié)果為差異不顯著(p>0.1)，說明運用四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化后得到的數(shù)學(xué)模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 綠豆粉山羊奶干酪的DSC測定分析

綠豆粉山羊奶干酪和純羊奶干酪進(jìn)行DSC的測定分析，熱焓曲線的變化如圖6所示，由圖6可知，純羊奶干酪的變性溫度為78.3 ℃，綠豆粉山羊奶干酪的變性溫度為82.4 ℃，加有綠豆粉干酪的的熱焓值變化較顯著，綠豆粉山羊奶干酪的吸收峰發(fā)生了遷移，變性溫度升高了4.1 ℃，這可能是由于綠豆粉所含的某些酶而引起蛋白質(zhì)的變性。

圖6 綠豆粉山羊奶干酪和純山羊奶干酪的DSC變化曲線Fig.6 DSC curve of improved mung bean powder goat cheese and pure goat cheddar cheese

2.4 傅里葉紅外光譜分析(FTIR)

如圖7所示，綠豆粉山羊奶干酪與純山羊奶干酪進(jìn)行的FTIR測定結(jié)果存在著一定的差異，說明綠豆粉中某些酶的作用而使得綠豆粉山羊奶干酪中蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在中紅外光區(qū)(500～4 000 cm-1)有若干的特征吸收峰。在酰胺I帶中綠豆粉山羊奶干酪的吸收峰比純山羊奶干酪的吸收峰較強，說明綠豆粉山羊奶干酪的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量要高于純山羊奶干酪，且在1 655 cm-1出現(xiàn)一個振動吸收峰。在酰胺Ⅲ帶(1 220～1 330 cm-1)中，純山羊奶干酪在1 229 cm-1處，出現(xiàn)了一個較強的吸收峰，此處為蛋白質(zhì)α-螺旋的特征吸收峰，此吸收峰是由于α-螺旋中N—H鍵的彎曲振動的結(jié)果，而綠豆粉山羊奶干酪在此處的吸收峰則較弱，說明蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，添加綠豆粉有助于干酪中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

圖7 綠豆粉山羊奶干酪和純羊奶干酪的傅里葉紅外光譜Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of goat cheese and pure goat cheese

3 結(jié)論

以干酪出品率為指標(biāo)，通過四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗得出較好的回歸數(shù)學(xué)模型，模型相關(guān)系數(shù)R2為0.89，表明模型較好，在試驗范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確預(yù)測干酪出品率；4個因素對干酪出品率影響順序為CaCl2的添加量>凝乳酶的添加量>發(fā)酵劑的添加量>綠豆粉的添加量。運用加權(quán)評分法最終確定制備綠豆粉山羊奶干酪的最佳方案為：發(fā)酵劑添加量1.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、CaCl2的添加量0.035%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、凝乳酶的添加量0.045%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、綠豆粉的添加量0.90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。經(jīng)過試驗驗證干酪出品率可達(dá)9.64%。綠豆粉山羊奶干酪與純山羊奶干酪DSC及中紅外圖譜分析表明，向羊奶中添加綠豆粉制成的切達(dá)干酪出品率較高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

對綠豆粉山羊奶干酪的研究為制備特定風(fēng)味需求的干酪系列產(chǎn)品的開發(fā)提供了指導(dǎo)。試驗中所用的綠豆是東北綠豆，可能會由于其產(chǎn)地的局限影響到試驗結(jié)果，還需選用不同產(chǎn)地的綠豆進(jìn)行羊奶干酪制備的研究。