顧起宏 劉勝文 楊雯君

涎腺粘液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)是臨床最常見的涎腺惡性腫瘤之一，約占涎腺惡性腫瘤的30%，大多患者早期表現(xiàn)為無自覺癥狀，病灶生長相對緩慢[1-2]。該病可發(fā)生于任何年齡，以40～60歲為發(fā)病高峰[3-4]。其組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜、病理形態(tài)、分化程度不一與生物學(xué)行為存在不一致情況，導(dǎo)致患者的預(yù)后差異很大[5]。若能找到1種特異性和敏感性均較高的腫瘤標(biāo)記物，將為臨床診治與預(yù)后評估提供可靠的參考依據(jù)[6-7]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo protein,MMP-9)家族又稱明膠酶B(gelatinase B)，具有降解Ⅳ型膠原和明膠的功能[8]。當(dāng)前研究顯示MMP-9能夠破壞基底膜的完整性，有利于腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。不過MMP-9對不同惡性腫瘤的影響還不一致，各學(xué)者間在判斷某些因素是否影響臨床特征與預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)還不明確[10-11]。本文具體探討了MMP-9在涎腺粘液表皮樣癌中的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2016年2月到2018年1月，選擇我院病理科收集的手術(shù)切除粘液表皮樣癌標(biāo)本共計(jì)50例(癌組織組)，其中手術(shù)切除的腫瘤邊緣正常腺體組織50例(癌旁組，即組織距離腫瘤邊緣大于5 mm)，觀察組與對照組樣本都來自同一批患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：粘液表皮樣癌的診斷及病理分級依據(jù)2005年WHO的有關(guān)口腔組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷；臨床、病理資料完整；年齡20～80歲；醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)了此次研究；HE及免疫組化染色結(jié)果均經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師雙盲法閱片與協(xié)商取得結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床、病理資料缺項(xiàng)者；妊娠與哺乳期婦女。

其中男性28例，女性22例；年齡27～78歲，平均年齡(45.69±3.38)歲，中位年齡(47.02±3.39)歲；腫瘤部位：腮腺27例，腭部13例，舌頰部10例；惡性程度：低度惡性5例，中度惡性10例，高度惡性35例；治療方式：原發(fā)腫瘤擴(kuò)大切除或者腮腺/頜下腺全切除；低度惡性、中度惡性不頸清，高度惡性頸清；放化療指征：高度惡性，安全緣小于5 mm，頸淋巴結(jié)包膜外轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移數(shù)量多于1個(gè)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；腫瘤大小≥2 cm 10例，<2 cm 40例。

1.2 檢測方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片。HE染色后進(jìn)行免疫組化(S-P法)分析。兔抗人MMP-9單克隆抗體工作濃度為1∶200，購自北京中杉公司；二抗辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多克隆抗體，工作濃度1∶1000，購自北京中杉公司。

以陽性染色作為陽性對照，以PBS取代一抗作為陰性對照。選取經(jīng)過HE染色驗(yàn)證的乳腺癌組織石蠟塊，切出3 μm石蠟，將其放到載玻片上，以60 ℃的溫度烤片4 h；兩次二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水后進(jìn)行水洗；修復(fù)抗原，蒸餾水沖洗，5 min×3次；3% H2O2溶液處理15 min，PBS沖洗，5 min×3次；一抗4 ℃孵育12 h，PBS沖洗，5 min×3次；二抗25 ℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB室溫下3～5 min顯色，蘇木精復(fù)染1～2 min細(xì)胞核，以梯度酒精脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠進(jìn)行封片，鏡下觀察。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

MMP-9表達(dá)陽性率：隨機(jī)選擇具有代表性的10個(gè)高倍鏡視野，以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞，以視野下陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行綜合判定，無著色0分，著色淡1分，著色適中2分，著色深3分；陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞百分比≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50%為2分，>50%為3分，所著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比得分相乘，<2分為(-)，2～3分為(弱陽性)，4～6分為(中陽性)，>6分為(強(qiáng)陽性)，弱陽性+中陽性+強(qiáng)陽性都判斷為陽性。

MMP-9表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性：調(diào)查所有患者的性別、病案號、年齡、聯(lián)系電話、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等情況，分析在癌組織組中，MMP-9表達(dá)陽性與它們之間的相關(guān)性。

MMP-9表達(dá)陽性危險(xiǎn)因素分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用軟件SPSS 20.00分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、率等表示，計(jì)量數(shù)據(jù)的對比采用卡方(χ2)分析，影響因素分析用多因素非條件logistic回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9表達(dá)陽性率對比

癌組織組中MMP-9表達(dá)陽性率為92.0%(46/50)，癌旁組為10.0%(5/50)，兩組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.267,P<0.05)。

2.2 MMP-9表達(dá)與其臨床特征的相關(guān)性

在癌組織中，MMP-9表達(dá)陽性與腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)，與性別、年齡、發(fā)病位置無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 MMP-9在涎腺粘液表皮樣癌中的表達(dá)與其臨床特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 影響因素分析

在癌組織中，以MMP-9表達(dá)陽性作為因變量，以調(diào)查的臨床資料作為自變量，多因素非條件logistic回歸分析顯示：涎腺粘液表皮樣癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響MMP-9表達(dá)陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.872，2.114，P<0.05)，見表2。

表2 影響涎腺粘液表皮樣癌組織MMP-9表達(dá)陽性的多因素分析(n=50)

注：B為系數(shù)；SE為標(biāo)準(zhǔn)差。

3 討論

涎腺粘液表皮樣癌來源于涎腺導(dǎo)管上皮，是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，約占涎腺惡性腫瘤的30%[12]。該病可見于任何年齡，發(fā)病高峰年齡為40～60歲，最小發(fā)病者可在1歲以下，男性與女性的發(fā)病率無顯著差異[13]。根據(jù)涎腺粘液表皮樣癌的癌細(xì)胞分化程度和生物學(xué)特點(diǎn)分析，該病進(jìn)行高分化(低度惡性)、中分化(中度惡性)、低分化(高度惡性)等組織學(xué)分化，但是此種分化類型的判斷主觀性比較強(qiáng)，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用效果不佳[14]。

當(dāng)前研究顯示涎腺粘液表皮樣癌的預(yù)后與腫瘤的臨床特征密切相關(guān)，低分化型涎腺粘液表皮樣癌的侵襲性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高。當(dāng)前有學(xué)者也試圖用生物學(xué)標(biāo)記物來區(qū)分其惡性程度以獲得更客觀的評估[15]。MMP-9已成為當(dāng)前惡性腫瘤研究中的1個(gè)熱點(diǎn)，MMP-9能通過破壞基質(zhì)降解平衡而促進(jìn)癌細(xì)胞突破基底膜，從而侵襲周圍組織和轉(zhuǎn)移致遠(yuǎn)處組織。MMP-9也可以調(diào)控細(xì)胞間的相互支持，破壞原有的細(xì)胞間聯(lián)系[16]。MMP-9存在于腫瘤細(xì)胞周圍的基質(zhì)細(xì)胞，并不是直接存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)部[17]。本研究顯示癌組織組中MMP-9表達(dá)陽性率為92.0%，癌旁組為10.0%，兩組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)前也有研究顯示MMP-9可能改變基質(zhì)環(huán)境，從而影響腫瘤的發(fā)展；而腫瘤細(xì)胞可以通過可溶性介質(zhì)進(jìn)行信息交換，協(xié)同產(chǎn)生和調(diào)節(jié)MMP-9，從而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[18]。

涎腺粘液表皮樣癌是1種多因素參與、多步驟發(fā)展的疾病，也是由于正常涎腺組織細(xì)胞在其內(nèi)在/外界致病因素長時(shí)間作用下，發(fā)生惡性變化而形成的。而細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)包括DNA損傷、基因突變等，細(xì)胞周期的失調(diào)、細(xì)胞增殖、相互誘導(dǎo)是其所依據(jù)的重要環(huán)節(jié)。腫瘤組織中可出現(xiàn)血管生成現(xiàn)象，可穿過新生有缺陷的血管內(nèi)皮和基質(zhì)膜進(jìn)入血液循環(huán)，新生的血管為腫瘤組織細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)，是原位瘤生長和向遠(yuǎn)處擴(kuò)散的基礎(chǔ)[19]。本研究顯示在癌組織組中，MMP-9表達(dá)陽性與腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)，與性別、年齡、發(fā)病位置無相關(guān)性(P>0.05)；多因素非條件logistic回歸分析顯示涎腺粘液表皮樣癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響MMP-9表達(dá)陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.872,2.114，P<0.05)。當(dāng)前也有研究顯示在血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，MMP-9可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活物的表達(dá)，有利于瘤細(xì)胞在血管內(nèi)聚集及穿出瘤組織[20]。當(dāng)前也有研究顯示MMP-9由1個(gè)鋅離子依賴性的蛋白酶家族組成，MMP-9在不同水平上均受嚴(yán)格的調(diào)節(jié)，MMP-9可以潛酶的形式分泌到細(xì)胞外，也可受到基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑的調(diào)節(jié)[21]；MMP-9參與涎腺腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，聯(lián)合MMP-9抑制劑和抗血管生成藥，有望成為將涎腺粘液表皮樣癌的治療新靶標(biāo)[22]。不過本研究也有一定的不足，研究的樣本量有限，MMP-9的作用具體機(jī)制還不明確，其與臨床特征的相關(guān)性還有待于更進(jìn)一步的驗(yàn)證。

總之，MMP-9在涎腺粘液表皮樣癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，與臨床癌組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。