程哲，巢青，王大巍，束漢生

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蚌埠 233000）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有高病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率，其總體生存率和預(yù)后極差[1-2]。腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白2（tumor necrosis factor alpha induced protein 2, TNFAIP2） 廣泛調(diào)控各項(xiàng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP2 rs8126 單核酸多態(tài)性基因變異成為人類食管鱗狀細(xì)胞癌易感因素[3]；TNFAIP2 可以直接靶向調(diào)節(jié)KLF5從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]；鼻咽癌中TNFAIP2 是一種促進(jìn)細(xì)胞遷移的蛋白質(zhì)，其表達(dá)可作為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物[5]。TNFAIP2 在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP2 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)[6]，然而其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用siRNA 技術(shù)沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 和U251 中TNFAIP2 的表達(dá)，探討TNFAIP2 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、U373 和A172，正常人腦星形細(xì)胞株1800 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，SHG44 為蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院腦神經(jīng)研究所惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 和RPMI 1640 購自美國Thermo公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco 公司，TNFAIP2 及GAPDH 引物和Custom Real-Time PCR Gene Detection Assay 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Lipofectamine 2000、Trizol 均購自美國ABI 公司，CCK-8 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrigel 膠購自美國BD 公司，4%多聚甲醛、DEPC 水 購自北京索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U373、U251、A172 和SHG44分別用含10% 的FBS 的DMEM 或RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37℃含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱 連續(xù)培養(yǎng)，每2～3 天換液，以0.25%胰酶+0.02%乙 二胺四乙酸消化傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞維持對數(shù)生長。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞計(jì)數(shù)4×104～5×104接種在24 孔板上，細(xì)胞匯合達(dá)到30%～50%。A 液：在50 μl 的DMEM 無血清培養(yǎng)基加入1.25 μl 20 μmol/L si-RNA（si-TNFAIP2）輕輕搖勻，室溫放置5 min；B 液：用50 μl 無血清的DMEM 稀釋1 μl Lipofectamine 2000 試 劑，搖 勻室溫放置5 min；將A 液與B 液混合搖勻，室溫放置20 min；將100 μl A、B 混合液加到含400 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，輕輕搖勻；在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育4～6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h 后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（MOCK 組）不予特殊處理、陰性對照組轉(zhuǎn)染無意義序列（si-NC 組）和實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染干擾RNA 小分子（si-TNFAIP2 組）。TNFAIP2 小分子干擾RNA（si-TNFAIP2）由Gene Pharma 公司合成，si-TNFAIP2 正向：5'-CAUCAGAGGCAGAGUCAGA-3'，反向：5'-UCU GACUCUGCCUCUGAUG-3′

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 檢 測TNFAIP2 mRNA 在多株膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及在穩(wěn)轉(zhuǎn)后U87 和U251 細(xì)胞中的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，測定RNA 濃度。根據(jù)試劑盒中步驟：在每個反應(yīng)中加入2.0 μg RNA，70℃溫浴3 min，取出后冷卻至室溫，加0.5 μl 逆轉(zhuǎn)錄酶后置于37℃水浴60 min。20 μl 反應(yīng)體系中含2 μl CDNA，在Roche Light Cycler 480 儀器上進(jìn)行45 個循環(huán)反應(yīng)，按照95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 s。設(shè)3 個重復(fù)組，結(jié)果以2-ΔΔCt值計(jì)算。TNFAIP2 及GAPDH 的引物如 下：TNFAIP2 正向，5'-CCTGCTCTCCCTACGC-3'，反向，5'-CGTCCAAGATGCTCCG-3'；GAPDH 正向，5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，反向，5'-GGAAGA TGGTGATGGGATT-3'，以GAPDH 的mRNA 表達(dá)水平作為內(nèi)參。

1.2.4 細(xì)胞劃痕檢測U87、U251 細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期U251 和U87 細(xì)胞，用20 μl 無菌移液槍槍頭垂直培養(yǎng)板劃出貫穿培養(yǎng)孔的劃痕作為0 h 細(xì)胞遷移狀態(tài)。在培養(yǎng)板各孔添加正常含血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h 后再次拍照記錄。采用Image J2X軟件計(jì)算劃痕面積灰度值，劃痕愈合率=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1.2.5 Transwell 檢測U87、U251細(xì)胞侵襲能力 Matrigel 膠與培養(yǎng)基按1：6 比例稀釋以40 μl 每孔鋪于Transwell 小室，37℃ 0.5 h；將轉(zhuǎn)染后的U87 和U251 細(xì)胞以1×105個/孔接種于Transwell 小室上層，在含5% CO2的培養(yǎng)箱37℃環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)48～ 72 h 后，擦凈小室上層內(nèi)細(xì)胞，經(jīng)蘇木精固定30 min后再用1%結(jié)晶紫染色1 min，顯微鏡下隨機(jī)選取6 個視野拍照，采用Image J 2X 軟件對小室下層細(xì)胞計(jì)數(shù)取均值。

1.2.6 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測U87、U251 細(xì)胞增殖能力 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87 及U251 細(xì)胞（2×103個/孔）分別接種于96 孔板中，在轉(zhuǎn)染后的24、48 及72h 后再向每孔加入10μl CCK-8 試劑，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)4 h，在450nm 波長處測量吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 及GraphPad Prism 4.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNFAIP2 mRNA 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)

不同細(xì)胞中TNFAIP2 mRNA 相對表達(dá)水平：正常人腦星型細(xì)胞1800（1.86±0.25）、U87（5.76±0.47）、U251（4.98±0.34）、U373（6.35±0.52）、A172（5.81± 0.46）、SHG44（5.53±0.32），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.072，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，U87、U251、A172、U373 和SHG44 細(xì)胞中TNFAIP2 mRNA 的表達(dá)高于正常人腦星形細(xì)胞1800（P＜0.05）。見圖1。

2.2 siRNA 沉默U87、U251細(xì)胞中TNFAIP2 mRNA 的表達(dá)

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組TNFAIP2 mRNA 的表達(dá)：si-TNFAIP2 組（0.51±0.06）、si-NC 組（6.20±0.40）、MOCK 組（6.05±0.43），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.054，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，si-TNFAIP2 組TNFAIP2 mRNA 表達(dá)低于si-NC 組、MOCK 組（P＜0.05）。見圖2。U251 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TNFAIP2 mRNA 的表達(dá)，si-TNFAIP2 組（0.45±0.07）、si-NC 組（5.13±0.31）、MOCK 組（5.46±0.26），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=142.408，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，si-TNFAIP2 組TNFAIP2 mRNA 表達(dá)低于si-NC 組和MOCK 組（P＜0.05）。見圖2。

圖1 TNFAIP2 mRNA 表達(dá)的比較 （±s）

2.3 沉默TNFAIP2 表達(dá)抑制U87、U251 細(xì)胞遷移

U87 細(xì)胞遷移率：si-TNFAIP2 組（19.70±0.95）%、MOCK 組（50.16±2.54）%、si-NC 組（45.01±2.32）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.661，P=0.000）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)si-TNFAIP2 組抑制U87 細(xì)胞的遷移能力比MOCK 組、si-NC 組更強(qiáng)（P＜0.05）。U251 細(xì)胞遷移率：si-TNFAIP2 組（17.68± 1.75）%、MOCK 組（44.56±2.12）%、si-NC 組（50.26± 3.16）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.631，P=0.000）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)，si-TNFAIP2 組抑制U251 細(xì)胞遷移能力比MOCK 組、si-NC 組更強(qiáng) （P＜0.05）。沉默TNFAIP2 表達(dá)抑制U87、U251 細(xì)胞遷移見圖3、4。

圖3 沉默TNFAIP2 表達(dá)后U87、U251 細(xì)胞遷移能力比較 （×200）

圖4 U87、U251 細(xì)胞遷移率的比較 （±s）

2.4 沉默TNFAIP2 表達(dá)抑制U87、U251 細(xì)胞侵襲

U87 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)：si-TNFAIP2 組（45.33± 8.14）、si-NC 組（114.33±8.14）、MOCK 組（102.00± 11.36），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.225，P=0.000）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)，si-TNFAIP2 組抑制U87 細(xì)胞的侵襲能力比MOCK 組、si-NC 組更強(qiáng)（P＜0.05）；U251 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)：si-TNFAIP 組（52.33±4.16）、si-NC 組（122.33±5.86）、MOCK 組（113.67±14.57），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.641，P=0.000）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)，si-TNFAIP2 組抑制U251 細(xì)胞侵襲能力比MOCK 組、si-NC 組更強(qiáng)（P＜0.05）。見圖5、6。

2.5 沉默TNFAIP2 表達(dá)抑制U87、U251 細(xì)胞增殖

3 組U87 及U251 細(xì)胞24、48 和72 h 的吸光度值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：U87 細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值有差異（F=532.949，P=0.000），3 組間U87 細(xì)胞的吸光度值有差異（F=69.652，P=0.000），3 組間U87 細(xì)胞吸光度值的變化趨勢有差異（F=69.890，P=0.000）；U251 細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值有差異（F=413.597，P=0.000），3 組間U251 細(xì)胞的吸光度值有差異（F=793.612，P=0.000），3 組間U251 細(xì)胞吸光度值的變化趨勢有差異（F=55.243，P=0.000）。在24h 后si-TNFAIP2 組的吸光度值低于其他兩組。與MOCK 組及si-NC 組比較，沉默TNFAIP2 表達(dá)可抑制U87 和U251 細(xì)胞的增殖。見圖7和表1。

圖5 沉默TNFAIP2 表達(dá)后U87、U251 細(xì)胞侵襲能力比較 （×400）

圖6 U87、U251 細(xì)胞侵襲能力的比較 （±s）

圖7 沉默TNFAIP2 表達(dá)對U87、U251 細(xì)胞吸光度值變化趨勢

表1 各組U87 和U251 細(xì)胞在450 nm 波長處的吸光度值比較 （±s）

表1 各組U87 和U251 細(xì)胞在450 nm 波長處的吸光度值比較 （±s）

組別U87 U251 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h MOCK 組 0.43±0.10 1.99±0.27 3.03±0.14 0.60±0.09 1.86±0.04 2.86±0.14 si-NC 組 0.48±0.02 2.10±0.17 2.69±0.33 0.57±0.11 1.60±0.19 2.96±0.12 si-TNFAIP2 組 0.31±0.08 0.53±0.06 0.86±0.12 0.44±0.04 0.82±0.05 0.93±0.06

3 討論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞較強(qiáng)的增殖及侵襲特性是導(dǎo)致全切率低、術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后差的主要原因[7-9]，膠質(zhì)瘤的侵襲性與術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[10-11]。目前膠質(zhì)瘤的治療主要依賴手術(shù)最大范圍的切除，術(shù)后輔助放療、化療及免疫治療。腫瘤的精準(zhǔn)治療是最近比較熱門的話題，腦膠質(zhì)瘤的單克隆抗體治療也逐步應(yīng)用于臨床[12]，然而尋找調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲功能相關(guān)的基因越來越成為研究的熱點(diǎn)，膠質(zhì)瘤靶基因的研究也為精準(zhǔn)治療提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

大量研究表明，TNFAIP2 參與調(diào)控食管鱗狀細(xì)胞癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[13]及霍奇金淋巴瘤[14]，與癌 癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。食管鱗狀細(xì)胞癌中TNFAIP2 高表達(dá)，下調(diào)TNFAIP2 表達(dá)后可以通過激活Wnt/β-catenin 信號通路抑制癌細(xì)胞的侵襲遷移[15]； TNFAIP2 在乳腺癌標(biāo)本中高表達(dá)，且其表達(dá)量與乳腺癌的浸潤生長及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16]；鼻咽癌中NF-κB 可以上調(diào)TNFAIP2 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[17]。由此推斷TNFAIP2 參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移。目前，TNFAIP2 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及調(diào)控研究無相關(guān)的報(bào)道，有實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)TNFAIP2 在膠質(zhì)細(xì)胞及組織中高表達(dá)，是miR-184 在膠質(zhì)瘤中的直接靶基因[6]，然而TNFAIP2 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外功能的影響不是很明確。

本研究顯示，TNFAIP2 mRNA 在多株膠質(zhì)瘤細(xì)胞中處于表達(dá)上調(diào)狀態(tài)。而沉默TNFAIP2 可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；沉默TNFAIP2 表達(dá)后可以抑制U87 和U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果證明下調(diào)TNFAIP2 的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。據(jù)此筆者推測TNFAIP2 在膠質(zhì)瘤中可能起到癌基因作用。雖然發(fā)現(xiàn)抑制TNFAIP2 的表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和增殖，但是其具體機(jī)制尚不明確，由于實(shí)驗(yàn)限制沒有對侵襲及增殖、凋亡相關(guān)基因如MMP-2、Caspase 及BCL-2 等進(jìn)行檢測。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展涉及到多個靶基因及多個信號通路的異常調(diào)控，僅依靠單一的靶基因難以有效達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展[18-20]。仍需要高通量的基因測序和生物信息學(xué)等手段尋找TNFAIP2 可能的信號通路。

綜上所述，沉默TNFAIP2 表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲與增殖能力。TNFAIP2 有可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的分子靶標(biāo)，同時(shí)還需要進(jìn)一步的論證及機(jī)制研究。