王婷婷，卜歆，李金奎，王娜，邱意開，岳振生，蘇金，張淑雅

[1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 生育力保持教育部重點實驗室（生物化學與分子生物學系），寧夏 銀川 750004；2.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物教研室，陜西 西安 710032；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 急診科，寧夏 銀川 750004]

膠原的盤狀結構域受 體2（discoidin domain receptor 2, DDR2）是一種位于細胞膜的酪氨酸蛋白激酶受體，由胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域組成，胞外盤狀結構域被膠原識別并激活，進而介導盤狀結構域發(fā)生二聚化，觸發(fā)胞內催化結構域的酪氨酸殘基發(fā)生自磷酸化[1]。磷酸化的酪氨酸激酶介導細胞外基質膠原向細胞內的信號傳遞[2]。DDR2 高表達于激活狀態(tài)的血管內皮細胞（例如，心臟瓣膜內皮細胞發(fā)生內皮間充質轉化的過程[3]，腫瘤血管內皮細胞[4]）。前期研究發(fā)現，DDR2 自發(fā)全身性突變缺失小鼠腫瘤血管新生障礙，能顯著抑制腫瘤的生長與轉移。另有文獻[5]報道，DDR2 全身性敲除促進小鼠肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，提示DDR2 在生理和病理性血管新生中扮演十分重要的調控作用，但對血管內皮細胞中DDR2 對血管新生的調控機制尚不清楚。為深入研究血管內皮細胞中DDR2 在血管新生中的作用及分子機制，本研究設計基于同源重組理論，利用胚胎干細胞（embryonic stem cell, ES cell）（ES 細胞）打靶及顯微注射技術，復制DDR2flox/flox小鼠，利用Cre/LoxP 系統(tǒng)復制DDR2在血管內皮細胞可誘導性條件性基因敲除小鼠（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2），可以選擇性地在小鼠發(fā)育的不同時間誘導敲除血管內皮細胞中的DDR2，希望為深入研究DDR2 在生理性及病理性血管新生中的作用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6N 小鼠購自南京大學南京生物醫(yī)藥研究院，Cdh5-Cre/ERT2小鼠由空軍軍醫(yī)大學韓驊教授饋贈，所有實驗小鼠均按照無特定病原級動物飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 基因組提取試劑盒（北京天根生物有限公司），PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），瓊脂糖（上海碧云天生物技術公司），他莫昔芬（美國Sigma 公司），玉米油（美國Sigma 公司），小鼠CD146免疫磁珠（德國Miltenyi 公司，130-092-007），小號磁力柱（德國Miltenyi 公司，130-042-201），ECM 培養(yǎng)基（美國Scien Cell 公司，1001），DMEM（美國Hyclone 公司），IV 型膠原酶（美國Sigma 公司，C5138），100 μm 細胞篩網（美國BD 公司，352360），DDR2 抗體（美國R&D公司，MAB2538）。MACSTM 全自動組織處理器（德國Miltenyi 公司），低溫高速離心機（美國Eppendorf 公司），Olympus X71 倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），FC500 流式細胞儀（美國Beckman coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDR2 條件性基因敲除（conditional gene knockout, CKO）策略 小鼠DDR2基因全長116.64 kb，包含17 個外顯子，編碼的蛋白質由854 個氨基酸組成，本策略（見圖1）是在第2 個外顯子的下游內含子區(qū)插入FRT-Neo-FRT-LoxP 元件，在第3 個外顯子的下游的內含子區(qū)插入另外一個LoxP 位點，利用Cre 重組酶特異識別34 bp 的部分回文的LoxP 位點之間的序列，發(fā)生特異性地重組或刪除。導致第3 個外顯子區(qū)域的1.1 kb 序列將被Cre/LoxP 系統(tǒng)切除，形成移碼突變而阻止蛋白質的正常翻譯。

圖1 DDR2 CKO 策略圖

1.2.2 DDR2 CKO打靶載體的構建如圖2所示，含有靶基因的細菌人工染色體（bacterial artifical chromosome, BAC）克隆購自Invitrogen，從BAC 載體擴增5'-同源臂、3'-同源臂和DDR2 基因的靶向區(qū)域，然后將這3 個片段連接到具有第1 個LoxP 和FRTNeo-FRT 的第2 個LoxP 元件的載體中。在電穿孔進入ES 細胞之前，通過PCR、酶消化和測序確認靶向載體。PGK/EM7-NeoR 盒作為ES 細胞靶向步驟的陽性選擇標記，將Flox 表達菌株與floxed 小鼠雜交，或在ES 細胞階段表達Flpe 來除去。TK 是ES 細胞靶向步驟的陰性選擇標記，隨機插入靶基因的細胞將死于細胞毒性。

圖2 DDR2 CKO 打靶載體結構

1.2.3 ES 細胞克隆篩選及囊胚注射 將線性化的打靶載體，電轉到ES 細胞進行打靶，通過長片段PCR 及脫氧核苷酸（DNA）印跡法篩選出中靶克隆，將其注射于囊胚，并移植于受體小鼠子宮，得到嵌合體小鼠（嵌合率＞50%）。

1.2.4 DDR2flox/flox小鼠的復制 根據毛色篩選嵌合率在50%及以上的雄性鼠，將其與Flper 小鼠配繁一代，去除Neo 抗性基因，排除Neo 基因對小鼠表型分析的干擾，以獲得DDR2flox/flox小鼠。

1.2.5DDR2基因在血管內皮細胞可誘導性條件性基因敲除小鼠的獲得 篩選DDR2flox/+小鼠與Cdh5-Cre/ERT2小鼠雜交，并通過子代自交獲得DDR2 在血管內皮細胞可誘導性條件性基因敲除的純合子小鼠DDR2i?EC（DDR2flox/flox小鼠，Cdh5-Cre/ERT2）。

1.2.6 血管內皮細胞DDR2基因誘導敲除 在小鼠4周齡時，給予DDR2i?EC小鼠與同窩野生對照組（wild type, WT）小鼠腹腔注射他莫昔芬，劑量為66 mg/kg，連續(xù)給藥5 d。

1.2.7 肝血竇內皮細胞的分離、鑒定及DDR2 敲除效率分析 在小鼠8周齡時，用免疫磁珠法分離肝血竇內皮細胞，用流式細胞術鑒定細胞純度，應用定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）及蛋白免疫印跡法檢測血管內皮細胞DDR2 的表達。

1.2.8 肝臟病理切片HE 染色、天狼星紅染色及Masson 三色染色 在小鼠3月齡時，解剖DDR2i?EC小鼠的肝臟（選取同窩DDR2flox/flox小鼠肝臟為對照，WT），進行石蠟包埋，切片，通過HE 染色、天狼星紅染色、Masson 染色及免疫組織化學檢測肝臟的病理變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采 用Image Pro plus 6.0 和GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DDR2 CKO 打靶載體

所有質粒均經PCR 鑒定，終載體中FRT 位點至第2 個LoxP 位點間片段均存在。電轉后得到藥物抗性ES 細胞克隆6 個，分別經長片段PCR 及DNA blotting 鑒定，最終篩選出4 個陽性克隆。

2.2 嵌合體小鼠及DDR2 flox 小鼠

圖3 DDR2 CKO 小鼠基因鑒定結果

如圖3所示，顯微注射后得到由基因敲除ES 細胞和供體胚胎細胞共同發(fā)育而來的嵌合小鼠。挑選嵌合率在50%及以上的成熟雄性嵌合體小鼠與Flper 小鼠配繁一代后再與野生型B6 小鼠進行交配，得到的F1 代小鼠，經PCR 鑒定基因型后獲得雜合體（基因型表示為：Fln/WT）小鼠，218 與221 為雜合子小鼠，用于F0 代交配。

2.3 DDR2 血管內皮細胞可誘導性條件性基因敲除小鼠的繁育及鑒定結果

DDR2flox/flox小鼠與Cdh5-Cre/ERT2小鼠雜交，對后代自交后獲得的小鼠進行基因型鑒定，成功獲得DDR2 血管內皮細胞誘導性條件性基因敲除小鼠DDR2i?EC（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2）。見圖4。

2.4 血管內皮細胞DDR2 基因誘導敲除效率

用免疫磁珠法分離提取肝血竇內皮細胞，純度達到88.4%（見圖5A）。與對照組（WT）比較，DDR2在DDR2i?EC小鼠血管內皮細胞mRNA 表達下降＞95%（WT組為（1.032±0.092），DDR2i?EC組為（0.053± 0.025），t=6.246，P=0.002）（見圖5B）。與WT 組比較，DDR2 在DDR2i?EC小鼠血管內皮細胞中的蛋白表達下降＞95%（DDR2/β-actin 的比值在WT 組為（0.568±0.023），DDR2i?EC組為（0.020±0.010），t=8.839，P=0.001）（見圖5C、D），證明DDR2flox/flox和 Cdh5-Cre/ERT2能夠高效敲除血管內皮細胞上的DDR2，DDR2i?EC小鼠復制成功。

2.5 DDR2i ?EC 小鼠肝臟表型分析

3月齡DDR2i?EC小鼠肝臟呈現自發(fā)纖維化。肝臟病理切片HE 染色（見圖6A）顯示，DDR2i?EC小鼠肝血竇結構排列異常，大量炎癥細胞浸潤，天狼星紅染色 （圖6B、C）陽性區(qū)域與WT 組比較，DDR2i?EC組增加 （7.089±0.9852）倍（t=5.040，P=0.003）。Masson 染色 陽性區(qū)域顯示，與WT組比較，DDR2i?EC組增加（5.499± 0.9804）倍（t=6.480，P=0.001）（見圖6D、E）。上述 結果均表明DDR2i?EC小鼠肝臟膠原纖維沉積增多，尤其沉積在血管周圍，提示血管內皮細胞中DDR2 缺失導致肝臟發(fā)生自發(fā)性纖維化病變。

圖4 DDR2i ?EC 小鼠基因型的鑒定結果

圖5 肝血竇內皮細胞純度及DDR2 表達

圖6 DDR2i ?EC 小鼠呈現自發(fā)性肝纖維化

3 討論

作為細胞外基質膠原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及X 型）的DDR2，屬于膜表面受體型蛋白酪氨酸激酶[6]，膠原識別并激活DDR2，參與細胞增殖、遷移及細胞外基質的重塑[7]。主要在骨骼[8-9]、心臟[10]、皮膚[11]、腎[12]、肺[13-14]和卵巢[15]中高表達。近年來，DDR2 在血管新生中的作用受到重視，筆者的前期研究發(fā)現DDR2 高表達于腫瘤血管內皮細胞，腫瘤間質中DDR2 缺失能抑制腫瘤血管新生，抑制DDR2 可抑制肺纖維化過程中VEGF 的分泌而抑制病理性血管新生[16]，提示DDR2 在生理性及病理性血管新生中扮演中重要角色。但血管內皮細胞中DDR2 的作用尚未見報道，深入研究DDR2 在血管內皮細胞中的作用具有重要意義。本研究用基因打靶技術復制DDR2flox/flox小鼠，并將其與血管內皮細胞特異性Cre/ERT2小鼠（Cdh5 Cre/ERT2）進行交配，得到DDR2flox/flox和Cdh5Cre/ERT2小鼠，然后給予他莫昔芬誘導Cre 酶的活性，根據實驗需要，在特定時間特異性地敲除血管內皮細胞中DDR2，分離肝血竇內皮細胞，通過qPCR 及蛋白免疫印跡法檢測DDR2 敲除效率，發(fā)現血管內皮細胞中DDR2 的敲除效率高達90%以上，證明成功復制血管內皮細胞DDR2誘導性條件性基因敲除小鼠，為后續(xù)深入研究DDR2 在血管內皮細胞中的作用機制奠定基礎。在表型分析中發(fā)現，血管內皮細胞DDR2條件性基因敲除后會誘發(fā)小鼠自發(fā)的肝纖維化，筆者將在后續(xù)深入研究血管內皮細胞DDR2 缺失導致肝纖維化的機制。

條件性基因敲除小鼠是將某個基因修飾定位于某些特定類型的細胞或小鼠發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶技術[17]。目前條件性基因打靶主要使用來源于大腸桿菌P1 噬菌體的Cre/LoxP 系統(tǒng)。Cre/LoxP 系統(tǒng)主要由兩部分組成，Cre 重組酶和Cre/LoxP 位點。Cre/LoxP 誘導系統(tǒng)目前是最先進的工具之一，不僅用于特定的細胞類型，而且是在特定的時間敲除目的基因[18]。本研究引用血管內皮細胞的特異性Marker 基因Cdh-5（又稱為VE-Cadherin）調控Cre 的啟動子[19]，通過啟動子驅動Cre 重組酶的表達模式，可以在血管內皮細胞中完成特異性基因敲除[20]。在可誘導性條件性敲除的這個系統(tǒng)中，Cre 蛋白質被融合到一種突變的雌激素受體（ER）中，在未誘導的細胞中，Cre-ER 被隔離在細胞質中，不能發(fā)揮作用[21]。但是在給予他莫昔芬（是ER 突變體的配體）后，ER 和Cre 轉移到細胞核，Cre 酶識別loxp 位點的目的基因DDR2，在loxp 位點上將目的基因DDR2切除，使DDR2 在血管內皮細胞中不能轉錄和翻譯，從而在內皮細胞中特異性敲除DDR2，可誘導性敲除的優(yōu)勢在于可根據實驗需要選擇不同的時間點進行誘導敲除。

在小鼠的表型分析中發(fā)現，DDR2flox/flox和Cre/ERT2小鼠在給予他莫昔芬誘導后出現自發(fā)性肝纖維化，這是一個令人興奮的現象，提示血管內皮細胞中的DDR2在防御肝纖維化過程中扮演重要角色。文獻報道DDR2全身敲除小鼠慢性四氯化碳導致的肝纖維化模型中，DDR2 缺失導致肝纖維化加重[22]。要闡明血管內皮細胞中DDR2 在肝纖維化中的作用機制需要DDR2 內皮細胞條件性基因敲除小鼠，本研究復制的DDR2flox/flox和Cdh5-Cre/ERT2小鼠將為后續(xù)深入研究奠定基礎，具有非常重要的意義。