潘晶晶，佘曉燕，胡林福，施林巍，張 輝

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；2.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州313399）

竹子是禾本科竹亞科的多年生常綠植物，含有多種次生代謝產(chǎn)物［1］，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。竹葉及其提取物中含有豐富黃酮類及其苷類化合物、特種氨基酸及其肽類、多糖類、芳香性成分以及人體所必需的常量元素如Fe、Ca、Si等和微量元素如Mn、Cu、Mo、V、Ni等［2］，竹葉的提取物中含有黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)血脂、抗血栓、抗輻射、抗癌等功效［3］。在食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2011中，首次將竹葉抗氧化物作為添加劑，可使用在油脂、肉制品、火腿等食品中，竹葉黃酮也在2014年被批準(zhǔn)為新食品原料。

在香腸的制作和存放過程中，會(huì)加入一定量的亞硝酸鹽。隨著香腸存放時(shí)間的延長，原先添加的亞硝酸鹽會(huì)分解變成亞硝胺［4］。而香腸中油脂氧化也會(huì)產(chǎn)生丙二醛（MDA），降低了其營養(yǎng)價(jià)值、感官特性和食用安全性。竹葉提取物中黃酮、氨基酸、多糖等物質(zhì)具有抗氧化性，能阻遏食品氧化腐敗，黃酮的含量越高，抗氧化能力就表現(xiàn)得越強(qiáng)，所以竹葉提取物可以阻斷油脂的氧化，清除亞硝酸鹽化合物并且阻斷亞硝胺的合成［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同黃酮含量的竹葉提取物對腌肉的抗氧化，阻斷脂質(zhì)的自動(dòng)氧化、減少丙二醛和亞硝胺危害物質(zhì)的生成的效果，為竹葉提取物的進(jìn)一步開發(fā)和在工業(yè)上應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑 含有不同總黃酮含量的竹葉提取物由浙江圣氏生物科技有限公司提供，其中總黃酮含量分別為24%和18%。豬后腿肉、高原深井鹽、異VC鈉、亞硝酸鈉，食品級。甲醇，色譜純。乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、硫代巴比妥酸，分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 D60高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器，太倉市科教器材廠；DK-8D恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制作腌肉 選取肥瘦均勻的豬后腿肉，將肉切成長約10 cm、寬約10 cm的塊狀，稱取每塊的重量，計(jì)算出配料的用量，在表面均勻地抹擦上食鹽、亞硝酸鈉、不同濃度的樣品，然后于4℃冰箱冷藏室中腌制約20 d。

配料的用量取100 kg鮮肉用細(xì)鹽16 kg，亞硝酸鈉的添加量為0.15 g·kg-1，低黃酮含量的竹葉提取物、高黃酮含量的竹葉提取物各取0.5、1、2 g·kg-1，異VC鈉取1 g·kg-1，每組兩個(gè)平行，在腌制的上鹽階段加入。

1.2.2 檢測丙二醛含量 20 d后將腌制好的腌肉按照國標(biāo)GB 5009.181-2016的方法，采用高效液相色譜進(jìn)行腌肉中丙二醛的檢測。

（1）樣品處理。提取：稱取5 g腌肉樣品，置于錐形瓶中，加入50 mL三氯乙酸混合液，置于恒溫振蕩器上50℃振蕩30 min，取出，用雙層定量慢速濾紙過濾。衍生化：將濾液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各5 mL分別加在25 mL比色管中，加入5mL硫代巴比妥酸水溶液，在90℃水浴中反應(yīng)30 min，冷卻，取上清液過濾膜上機(jī)分析。

（2）液相色譜條件。色譜柱：C18柱5μm，4.6 mm×150 mm；流動(dòng)相：甲醇∶0.01mol·L-1乙酸銨＝30∶70（V∶V）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：532 nm。

（3）丙二醛含量計(jì)算。試樣中丙二醛的含量按式（1）計(jì)算：

式（1）中：X為試樣中丙二醛含量，單位為毫克每千克（mg·kg-1）；V為試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m為最終試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克（g）；c為從標(biāo)準(zhǔn)系列曲線中得到的試樣溶液中丙二醛的濃度，單位為微克每毫升（μg·mL-1）；1 000為換算系數(shù)。

1.2.3 檢測亞硝酸鹽剩余量 20 d后將腌制好的腌肉按照國標(biāo)GB 5009.33-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)采用分光光度法進(jìn)行檢測。

試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標(biāo)法測得亞硝酸鹽含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用Origin 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測丙二醛含量

丙二醛標(biāo)準(zhǔn)品在選取的HPLC條件下分離效果比較好，且色譜峰的保留時(shí)間均為2.91 min。其中丙二醛標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1左，添加了樣品的丙二醛色譜圖見圖1右。對0.45、1、10 ppm的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，其回歸方程：y＝135.050 43x-561 568×10-4，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 9，結(jié)果表明，丙二醛在0.45～10 ppm濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 左為1 ppm標(biāo)準(zhǔn)溶液丙二醛衍生物色譜圖，右為樣品中丙二醛衍生物色譜圖Fig.1 Left，the standard solution ofmalondialdehyde derivative chromatogram；Right，a chromatographic diagram ofmalondialdehyde derivatives in samples

圖2 丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Malondialdehyde standard curve

2.2 腌肉中丙二醛含量

將HPLC檢測得到的樣品的峰值代入公式（1），得到添加了不同濃度樣品腌肉的丙二醛含量，取平均值，并計(jì)算誤差，計(jì)算丙二醛的抑制率如表1。

表1 各樣品丙二醛含量Tab.1 Malondialdehyde content of each sample

圖3 樣品對丙二醛含量的影響Fig.3 The effect of sample on Malondialdehyde content

丙二醛（MDA）含量是肉制品中脂質(zhì)過氧化程度的直接定量指標(biāo)，直接關(guān)系到肉質(zhì)和貨架期。在相同的冷藏時(shí)間內(nèi)，肌肉中的MDA含量越高，脂質(zhì)過氧化速度就越快，肉質(zhì)變差的時(shí)間就越短，肌肉貨架期就相對較短［6］。結(jié)果表明，在不同總黃酮含量的竹葉提取物作用下，20天后腌肉中的MDA含量減少，其中高黃酮含量竹葉提取物的效果優(yōu)于低黃酮含量竹葉提取物，但弱于異VC鈉。

隨著高黃酮含量竹葉提取物的濃度從0.05%增大到0.2%，其對MDA的抑制率由29.62%增加至85.07%，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。而低黃酮含量竹葉提取物隨著濃度從0.05%增大到0.2%，對MDA的抑制率從15.46%增加至37.53%，差異也達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)還選用了異VC鈉作為對照，異VC鈉是一種生物性食品抗氧化劑、防腐保鮮助色劑，少量異VC鈉即可達(dá)到較好的抗氧化效果。測定出0.1%異VC鈉對MDA的抑制率為57.51%，只有0.2%高黃酮含量竹葉提取物的抑制率85.07%超過了0.1%異VC鈉的效果，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），其他濃度樣品的抑制率均顯著小于異VC鈉的效果（P＞0.05）。由此看來，不同黃酮含量的竹葉提取物在腌肉腌制過程中都具有抗氧化效果，能起到抑制丙二醛的作用，并且高黃酮含量竹葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化功效，在0.2%濃度下能夠達(dá)到并超過常用抗氧化劑0.1%異VC鈉的效果，對脂質(zhì)過氧化物丙二醛的生成具有明顯的抑制作用。在梁仁龍［7］的研究中，添加竹葉抗氧化物可有效抑制醬鴨的菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮、過氧化值和酸價(jià)，對于肉制品有較好的抗氧化和保鮮的功效。

2.3 腌肉中亞硝酸鹽剩余量

測量得到添加了不同濃度樣品的腌肉中亞硝酸鈉含量，取平均值，并計(jì)算誤差，計(jì)算得到亞硝酸鈉的剩余量如表2。

表2 各樣品亞硝酸鈉剩余量Tab.2 Residual amount of sodium nitrite in each sample

圖4 樣品對亞硝酸鈉剩余量的影響Fig.4 The effect of sample on residual amount of sodium nitrite

在腌肉腌制過程中通常加入亞硝酸鹽，其在一定條件下會(huì)與二甲胺反應(yīng)生成N-亞硝基化合物，具有致突變和致癌性，過量食用存在安全性問題。在朱清清［8］的研究中，發(fā)現(xiàn)二甲基亞硝胺、二乙基亞硝胺和吡咯烷亞硝胺的殘留量隨著竹葉提取物添加量的增加而顯著降低，三種亞硝胺的抑制作用明顯；在徐濤［9］的研究中，發(fā)現(xiàn)隨著竹葉提取物含量的增加，腌制水產(chǎn)品中的亞硝胺量明顯下降，說明竹葉提取物對于亞硝胺的抑制有一定的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，腌肉腌制中亞硝酸鹽的添加量為150 mg·kg-1，剩余量越多，說明轉(zhuǎn)化為的亞硝胺越少，毒性越小。

由結(jié)果可以看出，相比于空白組，兩種添加物對亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化都有明顯抑制，且都隨濃度增大，抑制作用越明顯。隨著高黃酮含量竹葉提取物的濃度從0.05%增大到0.2%，亞硝酸鹽的剩余量從0.877 mg·kg-1增加到1.138 mg·kg-1，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。低黃酮含量竹葉提取物隨著濃度從0.05%增大到0.2%，亞硝酸鹽的剩余量從0.507 mg·kg-1增加到0.747 mg·kg-1，差異也能達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。

相比于對照組異VC鈉，不同黃酮含量竹葉提取物的抑制效果都弱于異VC鈉。在許鋼［10］等的研究中，適量的竹葉提取物可阻斷亞硝胺的合成；在樓鼎鼎［11］等的研究中，添加竹葉抗氧化物能有效降低制品中的亞硝酸殘留量，并呈顯著的量效關(guān)系，這都與本文的結(jié)果相符。綜合來說，竹葉提取物具有抑制亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝胺的能力，并且黃酮含量的越高，抑制能力越強(qiáng)，但其抑制作用都弱于異VC鈉。

3 結(jié)論

將不同黃酮含量的竹葉提取物添加到腌肉中，腌制20 d后，發(fā)現(xiàn)兩者對丙二醛均有顯著抑制，且0.2%高黃酮含量竹葉提取物的抑制率能達(dá)到85.07%，相比對照組0.1%異VC鈉提高了27.56%（P＜0.01），表明其對脂質(zhì)過氧化物丙二醛的生成有明顯的抑制作用。不同黃酮含量的竹葉提取物對抑制亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝基化合物有一定的作用，0.2%的高黃酮含量竹葉提取物可有效保留腌肉中亞硝酸鈉的含量，減少對人體有害的亞硝胺的生成。

竹葉提取物是一種較好的食品輔助功能性產(chǎn)品添加劑，具有良好的抗氧化和抑制丙二醛作用，抑制亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝胺的功效。本次實(shí)驗(yàn)為之后進(jìn)一步產(chǎn)品應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。但是目前得到的結(jié)論都是停留在宏觀上，對于其產(chǎn)生功效的作用機(jī)制，還需要從微觀結(jié)構(gòu)上進(jìn)行分析。并且在實(shí)驗(yàn)中使用的濃度并沒有經(jīng)過精確篩選，還需要進(jìn)一步優(yōu)化，探究濃度范圍?？偟膩碚f，竹葉提取物可作為一種天然有效的抗氧化劑應(yīng)用于食品中，具有廣闊的前景。