張 荔，孫付軍，李貴海

（1.湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000； 2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014）

大量研究表明，動脈粥樣硬化、血栓、高血壓及心力衰竭等心血管疾病均伴有血管內(nèi)皮細胞損傷[1-2]。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，一般是活性分子（如氧自由基）失調(diào)造成的，同時也是很多心腦血管疾病中內(nèi)皮細胞損傷的重要原因[3-6]。黃芪甲苷是黃芪的有效成分之一，有抗凋亡、抗氧化、減輕脂質(zhì)體過氧化、改善能量代謝等作用[7-9]。本研究中以黃芪甲苷作用于過氧化氫（H2O2）損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）模型，觀察各細胞因子水平，探討黃芪甲苷在相應(yīng)細胞粘附過程中的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試藥與儀器

細胞：人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVECs，上海博古生物有限公司，批號為BG018）。

試藥：黃芪甲苷粉劑（南京春秋生物有限公司，批號為 111920）；胎牛血清（批號為 42F9470K），維生素 E（批號為 00360），四氮唑鹽（MTT，批號為 0793），均購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號為1908121）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為 20180809），乳酸脫氫酶（LDH）試 劑盒（批號為20180809），蛋白定量（BCA）試劑盒（批號為 PC200898），均購自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶（美國HyClone公司，批號為Q6949）；三氯甲烷（美國Amresco公司，批號為67-66-3）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)試劑盒（美國Invitrogen公司，批號為00000541604）；細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為P0013）。

儀器：SW-CJ-2FD型超凈工作臺（新加坡Esco公司）；IL-161CI型 CO2培養(yǎng)箱（日本 Sanyo公司）；A1301049型低溫高速離心機（美國Beckman公司）；IX73型[1]倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；PTC-200型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)儀（美國Bio-Rad公司）；xMark型酶標儀（美國BioTek公司）；EX1103型電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；HZ211KB型汽浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)：用10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs，待細胞長至 70%～80%融合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，37℃條件下孵育2～3 min，顯微鏡下觀察細胞收縮變圓時棄去胰酶終止消化，巴氏滴管吸取培養(yǎng)液，吹打瓶壁制成細胞懸液，將細胞懸液接種于新的細胞瓶中傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)細胞數(shù)量每2～3 d傳代1次。

分組、建模及給藥：將對數(shù)生長期的HUVEC（密度為 5×104個 ／mL ），以每孔 200 μL 接種于 96孔板，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁生長后，棄去培養(yǎng)基，每5孔為1組，分為正常對照組（A組，常規(guī)培養(yǎng)基），H2O2組（B組，300 μmol／L H2O2），陽性對照組（C 組，300 μmol／L H2O2+50 μg／mL 維生素 E），以及黃芪甲苷高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，300 μmol／L H2O2+50.0，25.0，12.5 μg ／mL 黃芪甲苷）。

細胞活力測定：以MTT法測定。加藥培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入 5 μg／mL MTT 溶液 10 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，加入100 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，在490 nm波長處，以酶標儀測定每孔的吸光度值（A），以空白對照（培養(yǎng)基）作為100%存活對照，計算細胞活力。細胞活力（% ）=（A用藥組-A正常對照組）／（A正常對照組-A空白對照組）×100%。

LDH及SOD活性測定：加藥培養(yǎng)細胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，加100 μL細胞裂解液，裂解完全后按試劑盒說明書方法測定LDH及SOD活性。

單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）及細胞間黏附分子1（ICAM-1）mRNA表達測定：加藥培養(yǎng)細胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，收集細胞，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次[10]。實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線結(jié)果的可靠性，并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以MCP-1／β-actin及ICAM-1／β-actin比值分別代表各自相對表達水平，2-ΔΔCt法計算 MCP-1 mRNA、ICAM-1 mRNA的相對表達量。各組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)操作3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以表示，行單因素方差檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對模型細胞活力的影響

與A組比較，B組細胞活力顯著減弱（P＜0.01）；與B組比較，C組及D1組，D2組，D3組細胞活力顯著增強（P＜0.01）。詳見表 2。

表2 黃芪甲苷對模型細胞活力的影響（n=5）

2.2 對模型細胞LDH及SOD活性的影響

與A組比較，B組細胞LDH活性顯著增強，SOD活性顯著減弱（P＜0.01）；與 B 組比較，C 組及 D1組，D2組，D3組細胞LDH活性顯著減弱，SOD活性顯著增強（P＜0.01）。詳見表3。

表3 黃芪甲苷對模型細胞LDH和SOD活性的影響（U／mg，n=5）

2.3 對模型細胞MCP-1mRNA及ICAMmRNA的影響

與A組比較，B組細胞MCP-1 mRNA及ICAM-1 mRNA 表達顯著增強（P＜0.01）；與 B組比較，C組及D1組、D2組、D3組細胞MCP-1mRNA及ICAM-1mRNA表達顯著減弱（P＜0.01）。詳見圖1及圖2。

圖1 黃芪甲苷對模型細胞MCP-1 mRNA表達的影響（X ± s，n=5）

3 討論

本研究中通過H2O2誘導(dǎo)HUVEC建立氧化損傷模型，探討黃芪甲苷對HUVEC損傷的改善作用。H2O2能造成內(nèi)皮細胞損傷及功能紊亂。黃芪甲苷可促進HUVEC血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）上調(diào)，通過刺激VEGF的表達而促進血管新生[11]。

MCP-1作為趨化因子家族蛋白，可趨化單核細胞向血管內(nèi)皮的炎癥部位聚集，加劇活化巨噬細胞粘附血管內(nèi)皮，促進巨噬細胞進入血管壁形成泡沫細胞，加重血管炎癥，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成[12-13]。ICAM-1在動脈硬化早期細胞的遷移和增殖、泡沫細胞的形成中具有重要作用，也是動脈粥樣硬化病程中內(nèi)皮細胞表達過程的重要黏附分子[14]。細胞受損時，細胞胞漿會釋放LDH，因此將LDH的釋放率作為細胞受損程度的敏感指標之一[15]。SOD是一種胞內(nèi)氧化酶，可以清除氧自由基。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷能增強損傷模型細胞SOD活性，降低LDH活性，顯示黃芪甲苷能增強細胞的抗氧化能力，抵抗氧化應(yīng)激損傷，保護內(nèi)皮細胞。黃芪甲苷能降低損傷模型MCP-1 mRNA和ICAM-1 mRNA表達，通過抑制單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附和遷移，保護動脈粥樣硬化中受損的內(nèi)皮細胞。

綜上所述，黃芪甲苷對H2O2損傷模型HUVEC有一定改善作用，其機制可能與減弱MCP-1 mRNA和ICAM-1 mRNA表達有關(guān)。