劉洪巖，薛暉，張世勇，王江，趙沐子，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

3 Hepcidin

Hepcidin是一種富含半胱氨酸的多肽，最先在人源的hepcidin中發(fā)現(xiàn)其具有抗菌活性。此后，hepcidin在許多其他的脊椎動(dòng)物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，包括爬行類，兩棲類和魚類。在魚類中，hepcidin最先從雜交條紋鱸中發(fā)現(xiàn)，目前至少已經(jīng)在37種魚類中鑒定到了該抗菌肽[1]。Hepcidin一般是一個(gè)由4個(gè)二硫橋形成harpin-折疊，包含8個(gè)半胱氨酸，然而魚hepcidin序列分析表明，魚類hepcidin只含有4，6或7個(gè)半胱氨酸[2]。

魚類hepcidin基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了重復(fù)和多樣化的過程中，產(chǎn)生了多重基因拷貝的，最多能達(dá)到八個(gè)之多[2]。Hepcidin基因由3個(gè)外顯子和內(nèi)含子編碼一個(gè)信號(hào)肽，一個(gè)端功能前區(qū)和成熟肽。Hepcidin RNA轉(zhuǎn)錄的肽段大小的范圍可以從81到96個(gè)氨基酸，而成熟的hepcidin只有19～31個(gè)氨基酸，與分子量約2～3 kDa。hepcidin的等電點(diǎn)一般8以上，因此，hepcidin是陽離子抗菌肽。不過也有例外，如預(yù)測(cè)斜帶石斑魚的hepcidin等電點(diǎn)只有5.4[3]。

魚有兩種 hepcidin，hamp1和 hamp2。然而，hamp1在輻鰭魚和非輻鰭魚中都有發(fā)現(xiàn)，而hamp2只在輻鰭魚中有發(fā)現(xiàn)。此外，系統(tǒng)發(fā)育研究顯示hamp2存在正向選擇（但hamp1和哺乳動(dòng)物中同源的基因卻不存在），這表明不同的環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)化可能與宿主和病原體的相互作用有關(guān)。

與其他抗菌肽基因類似，魚類hepcidin可以由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)表達(dá)。此外，釀酒酵母、腫瘤細(xì)胞系如L-1210和SAF-1也可以誘導(dǎo)hepcidin的表達(dá)。魚類hepcidin基因也可以由病毒或聚I∶C以及有絲分裂原誘導(dǎo)表達(dá)。此外，環(huán)境雌激素內(nèi)分泌干擾物β-雌二醇下調(diào)大口黑鱸肝臟hepcidin 亞型基因的表達(dá)[1，2，4]。

人類的hepcidin是II型急性期相關(guān)蛋白，細(xì)菌感染后的表達(dá)時(shí)序證明，hepcidin的表達(dá)高峰在發(fā)生在細(xì)菌感染后3～6 h以及腐爛發(fā)生時(shí)[5]。虹鱒感染魯爾耶爾森氏菌后，hepcidin伴隨著感染急性期反應(yīng)蛋白如IL-1β，血清淀粉樣蛋白A和小腦肽的前體上調(diào)表達(dá)。因此hepcidin可以作為II型急性期蛋白，參與到魚類廣泛的先天免疫反應(yīng)中。

魚hepcidin抑菌普非常廣，對(duì)于革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑制濃度都在微米范圍內(nèi)，而且對(duì)大量魚類病原菌的活性很強(qiáng)，例如能夠殺死帶鞭毛的金黃色葡萄球菌和假單胞菌[5]。此外，hepcidin和moronecidin能夠協(xié)同作用抑制S.iniae和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[6]。并且，hepcidin對(duì)多種病毒起作用，人類的Hepc25能夠誘導(dǎo)STAT3活化，導(dǎo)致抗病毒通路開啟，從而抑制HCV病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[7]。很少有研究能夠闡明hepcidin對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制。在對(duì)人類的Hepc25研究中發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)抗菌肽不同，hepcidin作用于細(xì)菌時(shí)，并沒有發(fā)生膜通透性的改變，同時(shí)凝膠阻滯試驗(yàn)證明，人類的Hepc25可以與DNA高效結(jié)合[8]。魚類hepcidin中也有類似的試驗(yàn)結(jié)果。光發(fā)射動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明重組hepcidin前體、合成hepcidin同樣不會(huì)引起大腸桿菌膜通透性[5]。

魚hepcidin也具有抑制癌細(xì)胞生存的能力。例如，羅非魚hepcidin TH2-3，表現(xiàn)出濃度依賴方式抑制人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080a的增殖和遷移。此外，TH2-3能夠引起HT1080細(xì)胞膜破壞，并且能夠下調(diào)c-Jun基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TH1-5能夠調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，并且能夠在低劑量時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞（HeLa、HT1080 和 HepG2）生長，改變膜的結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，加入25 μM合成的Om-hepcidin或者5 μM合成的Omhepcidin前體，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降40%，與omhep1相比，pro-omhep1具有更好的抗HepG2細(xì)胞活性[9]。

魚hepcidin能夠調(diào)節(jié)不同的免疫相關(guān)基因的表達(dá)。TH1-5轉(zhuǎn)基因的斑馬魚能夠上調(diào)IL-10、IL-21、IL-22、溶菌酶的表達(dá)；TLR-1、TLR-3 上調(diào)斑馬魚TNF-α、NF-κB等基因的表達(dá)。然而，TH2-3則起到TH1-5的拮抗作用。對(duì)多寶魚的研究已經(jīng)表明，hepcidin能夠增加炎性細(xì)胞因子NF-κB的活性[10]。TH2-3也能夠在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白激酶C的表達(dá)，而且還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞在形態(tài)上產(chǎn)生類似于PMA誘導(dǎo)的變化[11]。此外，在病毒引起的胰腺壞死感染的中，TH1-5調(diào)節(jié)某些干擾素和膜聯(lián)蛋白的表達(dá)。

盡管具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用，hepcidin最關(guān)鍵作用是運(yùn)鐵素的調(diào)節(jié)因子。運(yùn)鐵素可以通過內(nèi)吞作用降解，這樣能夠減少血液對(duì)鐵元素的吸收。雖然在魚類中這種作用還沒有被證實(shí)，但是hepcidin具有調(diào)節(jié)鐵元素的能力。它也可以作為其他的二價(jià)金屬的受體，如果暴露在其他二價(jià)金屬如銅和鎘，hepcidin的表達(dá)水平會(huì)上調(diào)。

4 Cathelicidins

與其他抗菌肽不同，cathelicidins成熟肽之間的同源性并不高。它們有著保守的前體肽N端區(qū)域，叫作cathelin結(jié)構(gòu)域，成熟的有活性的抗菌肽由前體肽經(jīng)過蛋白酶解后釋放[12]。在哺乳動(dòng)物中，不僅在不同物種間，即使在同一物種中，成熟的cathelicidin序列也存在很大的變化?？偟膩碚f，所有的哺乳動(dòng)物cathelicidin成熟肽是陽離子抗菌肽，具有雙親性特征，在體外具有廣譜抗菌活性?？梢酝ㄟ^主要氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在C-末端有區(qū)顯著的序列相似性，具有很強(qiáng)的陽離子并且富含甘氨酸。

魚類中第一個(gè)cathelicidins來自大西洋盲鰻抗菌肽的分離，從編碼這些肽的cDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)它們具有同源性，這與哺乳動(dòng)物中cathelins是相同的。根據(jù)有無二硫鍵，魚cathelicidin分為兩種類型。研究魚cathelician發(fā)現(xiàn)一個(gè)高度的同源區(qū)域，這個(gè)區(qū)域似乎比哺乳動(dòng)物中cathelin結(jié)構(gòu)域更保守，成熟肽序列具有明顯的同源性（90%），而不同類別之間的同源性較小。此外，最近在鱈魚中發(fā)現(xiàn)了第三類cathelicidins，它們之間具有很高的同源性，但是與其它兩種類相比較缺乏同源性[13]。

由不同物種提純的cathelicidin，其體外抗菌活性表現(xiàn)出顯著的差異性。例如，鱈魚的cathelicidin對(duì)革蘭氏陰性菌具有較高活性但是對(duì)革蘭氏陽性菌幾乎不起作用，同時(shí)它還對(duì)白色念珠菌有很強(qiáng)的殺傷作用。與此相反，盲鰻cathelicidins對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌都有很強(qiáng)的作用，但對(duì)白色念珠菌的作用很弱[14]。虹鱒魚cathelicidins對(duì)Y.ruckeri的作用很強(qiáng)，而大西洋鮭魚cathelicidins對(duì)Y.ruckeri并沒有作用[15]。成熟肽序列的差異直接導(dǎo)致了抗菌活性的差異，可能是由于進(jìn)化過程中，對(duì)抗的病原不同而產(chǎn)生的進(jìn)化分歧。

基于其抗菌活性，cathelicidin在體內(nèi)的作用機(jī)理和表達(dá)模式基本上已經(jīng)研究清楚。抗菌肽的表達(dá)一般都是應(yīng)答病原刺激，如細(xì)菌和病原相關(guān)分子，而抗菌肽又能進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。重要的是，cathelicidin在早期胚胎中就發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，這說明它參與機(jī)體最早期的免疫。在體外培養(yǎng)的鮭魚胚胎中，細(xì)菌和細(xì)菌的DNA都足以誘導(dǎo)cathelicidin的表達(dá)，這表明像哺乳動(dòng)物一樣，魚的cathelicidin在宿主防御細(xì)菌中發(fā)揮類似的作用，但是純化的LPS并不能誘導(dǎo)所有魚類的cathelicidin基因表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這與基因變異有關(guān)。大鱗鮭魚的胚胎細(xì)胞就可以被I∶C、LPS、細(xì)菌的鞭毛蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，而在虹鱒巨細(xì)胞中cathelicidin可以被先天免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)IL-6誘導(dǎo)表達(dá)。此外，細(xì)菌及其產(chǎn)物可以誘導(dǎo)鱒魚細(xì)胞系cathelicidin基因的表達(dá)[16]。體內(nèi)研究進(jìn)一步支持了這一假說。當(dāng)香魚注射活菌后，會(huì)在鰓、肝、脾、腸等組織中，時(shí)間依賴性的表達(dá)cathelicidin[17]。此外，大西洋鮭魚和虹鱒感染Y.ruckeri后誘導(dǎo)抗菌肽cathelicidin的表達(dá)。大西洋鮭魚的鰓與殺鮭氣單胞菌孵育3 h之后可以產(chǎn)生cathe licidin，但是與鰻弧菌孵育則不能誘導(dǎo)cathelicidin表達(dá)。這表明抗菌肽cathelicidin在宿主防御中發(fā)揮作用的機(jī)制是復(fù)雜的[13]。

哺乳動(dòng)物抗菌肽已被證明具有多種活性，其免疫和非免疫活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過他們的體外抗菌活性。然而cathelicidin在魚類中的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于這一水平。最近的一項(xiàng)研究表明，兩種大西洋鮭魚catheli cidins可以快速、短暫的誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞表達(dá)IL-8[18]。這表明cathelicidin的免疫調(diào)節(jié)活性在哺乳動(dòng)物和魚類中是相似的，這可能是一種進(jìn)化上保守先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

5 魚類抗菌肽的應(yīng)用價(jià)值

所有抗菌肽特點(diǎn)都在理論上支持其發(fā)展成為治療藥物，包括廣譜抗菌活、生化穩(wěn)定性以及不產(chǎn)生耐藥性。魚類抗菌肽的特征更是為其應(yīng)用提供了無限可能?？傮w來說，魚類抗菌肽和其他物種的抗菌肽對(duì)于人源的病原體作用范圍幾乎相同，但是，它們對(duì)魚類病原體更加有效，因?yàn)樗鼈兒芸赡芘c病原體一起進(jìn)化。

由于很多抗菌肽在高鹽度環(huán)境中都是不穩(wěn)定的，來自于海洋魚類的抗菌肽就可以補(bǔ)充這一缺陷。例如pleurocidin可以在300 mM NaCl環(huán)境中保持類似于其他piscidian的活性[19]?；谶@種特性，pleurocidin可以被用于高鹽度的環(huán)境，如血清，眼膜高滲血癥等。除了抗菌藥物，一些魚類抗菌肽還具有體外抑制多種癌細(xì)胞的作用。

Piscidian已經(jīng)被開發(fā)成多種藥物了。例如，口服或注射epinecidin-1能顯著提高斑馬魚和石斑魚感染弧菌后的生存[20]；轉(zhuǎn)染epinecidin-1的斑馬魚和石斑魚在弧菌和無乳鏈球菌感染時(shí)，肌肉顯著減少創(chuàng)傷[21]。此外，用epinecidin-1治療耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染的小鼠，能夠通過降低細(xì)菌數(shù)目增加小鼠存活率，并且增加小鼠傷口的愈合和血管的生成[22]。epinecidin-1可以用于制造滅活病毒疫苗。注射epinecidin處理過的乙型腦炎老鼠病毒（JEV）后，感染病毒時(shí)小鼠的存活率可達(dá)到100%，其性能優(yōu)于福爾馬林滅活的乙腦病毒疫苗。這是因?yàn)閑pinecidin可以調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因，包括增加血清中抗JEV的抗體，從而抑制病毒在腦中的復(fù)制[18]。

魚hepcidin用于藥物處于試驗(yàn)階段。其中羅非魚hepcidin TH2-3孵育過的創(chuàng)傷弧菌，能夠增強(qiáng)感染和再感染時(shí)小鼠的存活率。TH2-3的抑制創(chuàng)傷弧菌的效果比四環(huán)素更好，并且在血腦屏障和肝臟中，也有同樣的結(jié)果。

魚類抗菌肽作為藥物使用，阻礙其進(jìn)一步發(fā)展的因素包括血清不穩(wěn)定性，多肽合成費(fèi)用高，以及蛋白酶不穩(wěn)定性。研究者也在探索解決這些問題的方法，包括找出更小的片段，如抗菌肽的活性部位，可能會(huì)表現(xiàn)出更好的活性，以及與常規(guī)的抗生素連用，通過協(xié)同作用降低傳統(tǒng)抗生素的使用濃度，從而降低細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生。

6 總結(jié)

魚類抗菌肽在結(jié)構(gòu)，基因組成和功能上都是非常多變的，也因此提供給我們一個(gè)豐富的抗菌肽庫。它們可以為更好地設(shè)計(jì)新型的治療劑提供重要信息，既可用于治療微生物感染，也可用于治療癌癥和其他病原菌感染。魚類抗菌肽的很多特點(diǎn)使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。特定的魚抗菌肽對(duì)魚類病原體有很強(qiáng)的活性，同時(shí)一些病原體在魚體內(nèi)誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生抗菌肽，這種復(fù)雜的關(guān)系表明抗菌肽機(jī)體是與病原體抗?fàn)幍漠a(chǎn)物，并且與病原體一同進(jìn)化。綜上所述，抗菌肽為魚類的宿主防御提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并且這些肽及其衍生物具有作為藥物開發(fā)的潛力。