牛曉靜，陳天朝，魯靜，施鈞瀚，馬彥江

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

還原糖是指具有還原性的糖類。在糖類中，分子中含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性。還原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麥芽糖等。關(guān)于還原糖的含量測定方法有3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)[1-2]、堿性酒石酸銅滴定法[3]、硫酸蒽酮法[4-5]和薩氏法[6]等；其中，DNS法操作簡便、快捷，雜質(zhì)干擾較少，適合批量測定，是目前實驗室測定還原糖最常用的方法。雖然目前有不少采用 DNS 法測定還原糖的研究，但是不同測量對象其測定條件也存在一定差異。有報道稱槐角中含有葡萄糖、果糖等還原糖[7]，而未見關(guān)于槐角中還原糖的含量測定方法。因此，本研究采用DNS法，通過對影響其測定結(jié)果最關(guān)鍵的因素，如檢測波長、DNS 用量和顯色時間等進(jìn)行探討，建立槐角中還原糖含量測定方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，為槐角中還原糖的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Evolution 201紫外分光光度計(賽默飛世爾科技公司)；CP225D分析天平(德國賽多利斯集團)；sartorius BSA224s-CW分析天平(德國賽多利斯集團)；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 材料

槐角(批號：150417；產(chǎn)地：山東)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定為豆科植物槐(SophorajaponicaL .)的干燥成熟果實；D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200503，含量以99.5%計)；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鈉鉀、結(jié)晶酚和亞硫酸鈉等均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取D-無水葡萄糖對照品，加水定容，配制成濃度為11.4 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1.0 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋，定容至刻度，即得對照品溶液，濃度為1.14 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取槐角樣品2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入50 mL水置50 ℃水浴中浸提2次，每次2 h，合并濾液，定容至100 mL量瓶中，即得供試品溶液，備用。

2.1.3 DNS試液的配制

稱取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸(DNS) 溶于少量蒸餾水中，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液262 mL，再加入185 g酒石酸鈉鉀、5 g結(jié)晶酚、5 g亞硫酸鈉，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中放置7天。

2.2 還原糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6個20 mL具塞試管中，補充蒸餾水至2 mL，混勻，加入1.5 mL DNS試液，搖勻后置沸水浴保持5 min，取出后以流水冷卻至室溫，定容至刻度，搖勻，即得。同時，以水為空白管對照，采用分光光度計測定(540±2)nm波長處的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.857 1X-0.081(r=0.999 8)，在0.228～1.368 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 槐角中還原糖的測定

取供試品溶液1.0 mL置20 mL具塞試管中，照上述方法，自“補充蒸餾水至 2 mL……”，測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試品中還原糖的含量。

2.4 顯色條件的優(yōu)化

2.4.1 測定波長的確定

文獻(xiàn)[1-2,8]中關(guān)于還原糖的測定方法采用的波長有 540、530、520、490 nm等，為此，筆者進(jìn)行了相關(guān)因素的分析。精密吸取對照品溶液、供試品和蒸餾水各1.0 mL，分別加入到20 mL具塞試管中，自“補充蒸餾水至2 mL……”，測定。再將對照品顯色液-水(空白)、DNS試液-蒸餾水(空白)、對照品顯色液-DNS(空白)、供試品顯色液-DNS(空白)試劑分別在波長為480～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果見圖1。

從圖1中可以看出，以DNS試液為空白時，對照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長分別為520 nm和489 nm。但以水為空白時，DNS試液在此處也有較強的吸收；且樣品顯色消耗了部分DNS試液，造成空白對照中實際DNS含量多于樣品顯色液，使得樣品在520 nm和489 nm處的測定均干擾嚴(yán)重。從曲線1可以看出，在λ=540 nm時，曲線2和4基本重合，曲線3和5基本重合，DNS試液的干擾較小。故選擇最佳測定波長為(540±2)nm。

注：1:DNS試液-水(空白);2:供試品顯色液-水(空白);3:對照品顯色液-水(空白);4:供試品顯色液-DNS試液(空白);5:對照品顯色液-DNS試液(空白)。圖1 測定波長選擇光譜圖

2.4.2 DNS試液用量優(yōu)化

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)，通過紫外分光光度計測定吸光度，對DNS試液用量進(jìn)行優(yōu)化。精密量取供試品溶液1.0 mL于20 mL具塞試管中，補充蒸餾水至2 mL，混勻，分別加入DNS試液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，搖勻后置沸水浴加熱，取出后以流水冷卻至室溫，定容至刻度即可。同時，以水為空白管對照，在(540±2)nm 波長處測定吸光度。結(jié)果如圖2所示，隨著DNS試液用量的增多，吸光度逐漸增大，但當(dāng)DNS試液加入量>1.5 mL時，吸光度趨于平穩(wěn)。因此，確定DNS用量1.5 mL為最優(yōu)。

2.4.3 顯色時間的優(yōu)化

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)，通過紫外分光光度計測定吸光度，對其顯色時間進(jìn)行優(yōu)化。精密量取供試品溶液1.0 mL于20 mL具塞試管中，補充蒸餾水至2 mL，混勻，分別加入DNS試液1.5 mL，搖勻后置沸水浴分別加熱3、5、7、9、11 min，取出后以流水冷卻至室溫，定容至刻度即可。同時，以水為空白管對照，在(540±2)nm波長處測定吸光度。結(jié)果如圖3所示，隨著顯色時間的延長，吸光度快速升高，并在5 min后達(dá)到平穩(wěn)。因此，確定顯色時間為5 min。

圖2 DNS試液加入量的影響

圖3 顯色時間的影響

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液1.0 mL，按照“2.2”項下測定方法顯色并測定吸光度，重復(fù)測定6次，RSD為0.41%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液1.0 mL，按照“2.2”項下測定方法顯色，每隔10 min分別測定1次吸光度，60 min內(nèi)RSD為0.78%(n=6)。結(jié)果表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗

分別精密稱定同一槐角樣品，按照“2.1.2”項下分別制備6份供試品溶液，按照“2.2”項下測定方法顯色并測定吸光度，計算樣品中還原糖含量為2.39%，RSD為2.08%(n=6)。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗

稱取槐角樣品1 g，共9份，精密稱定，分別精密加入D-無水葡萄糖對照品儲備液3.0，2.0，1.0 mL，按照“2.1.2”項下分別制備9份供試品溶液。按照“2.2”項下方法顯色并測定吸光度，計算平均回收率為98.43%，RSD為1.54%(n=9)。結(jié)果表明方法回收率良好。結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 關(guān)于DNS試液的配制

DNS試液的配制決定了還原糖測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、穩(wěn)定。文獻(xiàn)中有關(guān)DNS試液的配制有多種方法[3,9-10]，大多數(shù)采用文中方法，在實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，DNS的加入需少量多次，緩慢加入，可借助于磁力攪拌，邊加邊攪拌，否則，一次加入太多，會立即析出大量橙黃色絮狀沉淀。此外，配制溫度不要超過50 ℃，否則，溫度太高，溶液顏色容易變黑。

表1還原糖加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

編號取樣量(g)樣品含量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.000 223.904 834.200 058.002 399.7021.000 623.914 334.200 058.012 699.7031.000 523.912 034.200 057.992 399.6541.000 623.914 322.800 045.895 696.4151.000 723.916 722.800 046.885 2100.7498.431.5461.000 223.904 822.800 046.032 597.0571.000 523.912 011.400 035.023 697.4781.000 323.907 211.400 035.012 697.4291.000 123.902 411.400 035.045 897.75

3.2 供試品溶液處理方法的篩選

課題組對供試品溶液的處理方法中加熱條件、是否除雜等進(jìn)行優(yōu)化[11-14]。曾采用沸水浴回流和50 ℃水浴浸提兩種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 ℃水浴浸提效果優(yōu)于沸水浴回流，可能是由于沸水浴溫度太高會造成還原糖的分解。此外，筆者還嘗試采用石油醚(60 ℃～90 ℃)對槐角先脫脂除雜，然后再進(jìn)行50 ℃水浴浸提，實驗發(fā)現(xiàn)，除雜會降低還原糖的含量，容易造成部分還原糖損失，數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；因此，直接加水浸提，不進(jìn)行除雜，減少中間繁瑣步驟。

3.3 顯色方法優(yōu)化

課題組對影響顯色方法的DNS用量和顯色時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果DNS試液用量為1.5 mL，沸水浴加熱顯色時間5 min即可。方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，結(jié)果可靠。