張鴻彬，藺湘寧，王鵬飛，尚菁，王強(qiáng)，李玉霞，段淑文，王小榮*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.石家莊平安醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

小兒厭食癥(Infantile anorexia,IA)[1]是指以小兒長(zhǎng)期食欲減退或食欲缺乏為主要癥狀的一種疾病。中醫(yī)古代文獻(xiàn)中并無厭食癥病名，但依據(jù)證候?qū)W可將其歸為“傷食”“積滯”“疳積”等范疇。屬于學(xué)齡前兒童和青少年時(shí)期最為常見的疾病之一，由于這個(gè)時(shí)期的兒童正處于生長(zhǎng)發(fā)育期，若不能攝取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，則會(huì)影響正常發(fā)育，出現(xiàn)發(fā)育遲緩，免疫力下降和智力障礙等一系列問題。

代謝組學(xué)是近年來發(fā)展起來的一種新興學(xué)科，是研究生物體被擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物(一般指相對(duì)分子質(zhì)量<1 000的小分子代謝物質(zhì))的種類、數(shù)量及變化規(guī)律的科學(xué)[2]。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中展現(xiàn)了其特色和明顯的優(yōu)勢(shì)[3-4]。但關(guān)于IA的代謝組學(xué)研究目前還少有報(bào)道，本研究利用代謝組學(xué)研究方法，以IA模型大鼠血清為研究對(duì)象，采用LC-Q/TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模式識(shí)別的方法，發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物并鑒定，解析代謝通路，初步從代謝組學(xué)角度探析IA的生物學(xué)本質(zhì)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

采用美國(guó)安捷倫科技公司LC-Q/TOF-MS儀器分析平臺(tái)；VELOCITY 18R臺(tái)式高速離心機(jī)(澳大利亞Dynamica公司)；DV314C精密電子分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；ULFT386冰箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 試劑與藥物

LC-MS級(jí)乙腈(德國(guó)Merck公司)；HPLC級(jí)甲醇(德國(guó)Merck公司)；甲酸(上海CNW公司)；超純水(德國(guó)Merck公司)；2-氯苯丙氨酸[吉爾生化(上海)有限公司]；高脂飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斷乳后1周齡的SPF級(jí)SD大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量(60±10)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0005。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±20)%，明暗周期為12 h。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雌雄及體質(zhì)量根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法分為空白組(K組)20只，模型組(M組)100只。

2.2 模型制備

參照汪受傳等[5]特制高脂飼料喂養(yǎng)幼齡大鼠建立IA模型的方法，各組大鼠雌雄分開，空白組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，模型組以高脂飼料喂養(yǎng)(采用奶粉、玉米粉、鮮雞蛋、鮮肥肉、魚肉松、黃豆粉和白糖按比例混勻制成)，自由進(jìn)食飲水，共飼養(yǎng)5周。實(shí)驗(yàn)過程中，每日定時(shí)稱取和記錄大鼠食量和體質(zhì)量。當(dāng)模型組大鼠食量降低40%～60%，或者當(dāng)體質(zhì)量低于正常組的10%～15%，但不出現(xiàn)蜷臥、弓背聳肩以及腹瀉等脾虛癥狀時(shí)，即認(rèn)為造模成功。

2.3 樣本采集與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)最后各組股靜脈取血4 mL，備檢。血清標(biāo)本處理：室溫靜置1 h使血液凝固析出血清，用離心機(jī)以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，用移液器收集上清液，放置到-80 ℃冰箱保存，待檢。

2.4 樣本前處理與檢測(cè)

將大鼠血清樣本從冰箱取出，放置室溫解凍，每個(gè)樣本取100 μL血清樣本至1.5 mL EP管中，然后加入300 μL甲醇，并加入10 μL的內(nèi)標(biāo)(2.9 mg/mL，2-氯苯丙氨酸)，渦旋30 s，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。取上清液200 μL，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 色譜條件

C18色譜柱(Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，流速0.35 mL/min；流動(dòng)相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；進(jìn)樣量為4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃。

2.6 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，同時(shí)進(jìn)行正負(fù)全離子模式掃描。正離子模式條件為：毛細(xì)管電壓4 kV，錐孔電壓35 kV，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃，反向錐孔氣流50 L/h，脫溶劑氣600 L/h，萃取錐孔4 V。

負(fù)離子模式檢測(cè)條件：毛細(xì)管電壓3.5 kV、錐孔電壓50 kV、離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣700 L/h、萃取錐孔4 V。離子掃描時(shí)間0.03 s、掃描時(shí)間間隔0.02 s、數(shù)據(jù)采集范圍：50～1 000 m/z。

2.7 數(shù)據(jù)處理

2.7.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.7.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

所獲得樣本數(shù)據(jù)用Mass Profiler軟件(Agilent公司)進(jìn)行預(yù)處理，并在Excel 2010中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包含保留時(shí)間、分子量、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)等信息。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。采用OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)的P值(P<0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。搜索在線數(shù)據(jù)庫(kù)(Metlin)為差異性代謝物定性。應(yīng)用MetPA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析代謝通路，將篩選出的代謝物的HMDB編號(hào)輸入進(jìn)行代謝通路分析，然后通過檢索代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)知識(shí)，探討潛在生物標(biāo)志物相關(guān)生物學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 攝食量、體質(zhì)量變化情況

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，開始正式實(shí)驗(yàn)，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)觀察兩組大鼠的生長(zhǎng)狀況，M組大鼠在造模后第7天開始食量、體質(zhì)量低于K組，持續(xù)4周，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均有顯著性差異。見表1、表2和圖1。M組大鼠從第28天開始日進(jìn)食量低于K組40%～60%，體質(zhì)量從第7天開始比K組降低10%～15%，不伴有腹瀉、毛枯、少動(dòng)等其他癥狀，符合IA的臨床表現(xiàn)，提示造模成功[5]。

組別第1 d第7 d第14 d第21 d第28 d第35 d總計(jì)F值PK組7.45±0.9411.49±1.4314.44±1.9316.07±2.1420.14±3.0623.41±3.5515.5±0.64199.67<0.001M組7.64±0.539.32±0.6910.42±0.9910.79±0.9911.24±1.0311.02±0.9910.07±0.08673.34<0.001總計(jì)7.63±0.579.52±1.0010.78±1.5911.27±1.8912.05±2.8912.14±3.84—1 139.7?<0.001?t值-0.6364.7446.5247.7299.13611.014313.32?(F=484.08,P<0.001)#P0.5390.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001?

注：*主效應(yīng)的F值和P值；#交互效應(yīng)的F值與P值。

組別第1 d第7 d第14 d第21 d第28 d第35 d總計(jì)F值PK組62.30±8.0696.30±9.30140.90±19.49177.80±20.50202.60±24.10236.90±32.54152.80±5.42261.88<0.001M組62.08±2.5988.06±6.87120.94±15.74149.28±16.55166.61±13.44199.19±17.58131.03±1.185 789.25<0.001總計(jì)62.10±3.3888.81±7.46122.75±17.02151.87±18.74169.88±17.89202.62±22.06—2 260.45?<0.001?t值0.0863.4963.7415.0844.653.61328.16?(F=38.23,P<0.001)#P0.9330.001<0.001<0.0010.0010.005<0.001?

注：*主效應(yīng)的F值和P值；#交互效應(yīng)的F值與P值。

圖1 大鼠食量、體質(zhì)量方差輪廓圖

3.2 原始色譜圖的可視化結(jié)果

經(jīng)過色譜柱分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，每次掃描得到一張質(zhì)譜圖，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，正模式下單個(gè)樣本TIC圖(圖2)所示，M組與K組的圖譜在同一時(shí)間點(diǎn)的峰度值差異較大，提示該處的化合物信息有較大差異，IA模型大鼠體內(nèi)代謝被擾動(dòng)。

3.3 血清代謝組學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)首先使用PCA進(jìn)行比較，顯示兩組明顯區(qū)分(圖3)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證分類的可靠性，采用了OPLS-DA對(duì)兩組樣本重新建模分析,得到很好的區(qū)分模型(圖4)。

注：K：空白組；M：模型組。圖2 單個(gè)樣本TIC圖

注：A：正模式；B：負(fù)模式。圖3 M-K兩組的PCA得分圖

注：A：正模式； B：負(fù)模式。圖4 M-K兩組的OPLS-DA得分圖

3.4 IA潛在生物標(biāo)志物鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1)，結(jié)合t檢驗(yàn)的P值(P<0.05)來尋找差異性代謝物。利用質(zhì)譜的質(zhì)核比或者精確分子質(zhì)量搜索HMDB，METLIN，KEGG等在線數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索到相對(duì)應(yīng)的化合物，得到30個(gè)差異性代謝物，見表3。

表3M-K兩組的差異性代謝物

名稱VIP保留時(shí)間分子量P值離子模式趨勢(shì)膽紅素2.487.714584.263 5<0.001+↑膽堿1.880.661103.099 80.002+↓檸檬酸1.391.037192.027 30.028+↓D-β-羥基丁酸1.501.264104.047 60.016+↓左旋肉堿1.890.683161.105 30.002+↓L-谷氨酸2.120.693147.053 3<0.001+↓L-組氨酸1.500.644155.069 00.017+↓LysoPC(14:0)1.7811.181467.300 00.002-↑LysoPC(15:0)1.5411.618481.315 30.007-↑LysoPC(16:1(9Z))1.4010.109493.317 20.026+↑LysoPC(20:2(11Z,14Z))1.2911.277547.364 50.041+↑LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))1.4310.259543.333 10.023+↑LysoPC(22:2(13Z,16Z))2.4712.515575.394 9<0.001+↑LysoPC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))1.6111.120571.364 00.010+↑LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))1.8310.819569.348 30.003+↑煙酰胺1.531.002122.048 20.014+↓磷酸膽堿1.4310.744183.066 20.023+↓磷酰膽堿2.126.961169.052 8<0.001+↑植物鞘氨醇1.328.009317.293 20.036+↓維生素A酸2.1710.931300.209 2<0.001+↓磷酸鞘氨醇2.489.645381.264 5<0.001+↓神經(jīng)鞘氨醇1.639.317299.282 70.009+↓12-酮基脫氧膽酸1.308.813390.274 80.025-↑4-甲基馬尿酸1.335.184193.072 10.021-↓乙酸1.470.66060.021 30.011-↓脫氧膽酸1.589.038392.290 50.006-↓油酸1.1614.523282.254 90.047-↓?；悄懰?.407.469515.289 90.015-↑牛磺脫氧膽酸1.587.412499.294 70.006-↑尿酸1.870.995168.027 00.001-↓

注：名稱為差異代謝物名稱；VIP為OPLS-DA模型構(gòu)建時(shí)不同物質(zhì)對(duì)模型的貢獻(xiàn)率；P值為t檢驗(yàn)得到顯著性值；趨勢(shì)是M組相對(duì)于K組的趨勢(shì)。

3.5 代謝通路分析

應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0分析代謝通路。利用拓?fù)浞治?，代謝通路影響的臨界值設(shè)置為0.01，大于該值將選擇作為潛在的關(guān)鍵代謝通路(圖5，表4)。如圖5所示，圖中圓點(diǎn)越大、顏色越紅，說明富集的差異代謝物越多，差異代謝物對(duì)該點(diǎn)代表的通路的影響越大。

表4IA模型大鼠代謝通路

NO.相關(guān)代謝途徑代謝物總數(shù)期望值擊中值-log(P)影響值1鞘脂類代謝210.6333.780.202精氨酸和脯氨酸代謝441.3243.230.173甘油磷脂代謝300.9032.850.114組氨酸代謝150.4522.630.245D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝50.1511.961.006谷胱甘肽代謝260.7821.710.077卟啉與葉綠素代謝270.8121.650.048煙酸和煙酰胺代謝130.3911.120.249乙醛酸和二羧酸代謝160.4810.950.3010視黃醇代謝170.5110.900.2211三羧酸循環(huán)200.6010.780.0512丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝240.7210.650.2613嘌呤代謝681.3112.980.0214丙酮酸代謝220.4222.730.06

注：橫坐標(biāo)表示通路影響值；縱坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)換后的P值。圓點(diǎn)的大小表示富集的差異代謝物數(shù)量，點(diǎn)越大，富集代謝物越多。顏色表示顯著性，顏色越深，P值越小。圖5 代謝通路影響值

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，小兒為稚陰稚陽(yáng)之體，臟腑嬌嫩，形氣未充，具有“三不足、四有余”的特點(diǎn)，任何影響到脾胃運(yùn)化的因素都可導(dǎo)致厭食的產(chǎn)生。如錢乙《小兒藥證直訣》中言：“脾胃不和，不能乳食，致肌瘦”，《幼幼集成·積食證治》云：“脾虛不運(yùn)則氣不流行，氣不流行則停滯而為積，或作瀉痢，或成痞，以致飲食減少”。本研究從代謝組學(xué)的角度探析IA的生物學(xué)特征，以期為IA的進(jìn)一步研究提供參考。

結(jié)果顯示，M組與K組之間代謝差異物主要集中在脂類代謝、氨基酸類代謝和三羧酸循環(huán)等代謝途徑中，提示IA的發(fā)病過程與這些代謝的紊亂有密切的關(guān)系。

膽堿作為甘油磷脂代謝的產(chǎn)物，是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成前體物質(zhì)，并且是磷酰膽堿、溶血卵磷脂(LysoPC)和鞘磷脂的組成成分，在動(dòng)物大腦發(fā)育和維持神經(jīng)的正常功能方面起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)期幼鼠缺乏膽堿會(huì)造成大腦結(jié)構(gòu)和功能永久性損傷[6-9]。膽堿作為人和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[10]，其代謝的紊亂對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，信號(hào)基質(zhì)的傳遞都會(huì)造成一定的干擾，最終擾動(dòng)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[11]。磷酰膽堿的降解產(chǎn)物磷脂質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的關(guān)鍵成分，并在信號(hào)傳導(dǎo)和代謝中起著重要作用[12]。溶血卵磷脂通過磷脂酶水解磷脂酰膽堿生成，可以啟動(dòng)卵磷脂受體，進(jìn)行酯信號(hào)傳導(dǎo)，完成膜內(nèi)外蛋白的交換[13]。M組膽堿下降，溶血卵磷脂和磷酰膽堿上升，這種變化擾動(dòng)了的甘油磷脂代謝通路，其代謝通路的整體變化也會(huì)引起甘油磷脂功能的異常，從而可能引起細(xì)胞生理平衡的紊亂。

4.1 氨基酸代謝

谷氨酸、組氨酸在IA模型大鼠血清中含量較K組顯著降低，表明氨基酸代謝在IA發(fā)病過程中受到很大的影響。L-谷氨酸是蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分，雖然不是人體必需氨基酸，但可作為碳氮營(yíng)養(yǎng)參與機(jī)體代謝，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]。在氨基酸合成途徑中，谷氨酸又是合成谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和谷胱甘肽的重要前體。谷氨酸在上皮細(xì)胞和草酰乙酸通過氨基交換產(chǎn)生α-酮戊二酸和天冬氨酸。谷氨酸在丙酮酸存在的情況下能通過轉(zhuǎn)氨產(chǎn)生丙氨酸和α-酮戊二酸。通過氨基交換產(chǎn)生的α-酮戊二酸能夠進(jìn)入線粒體，然后進(jìn)入三羧循環(huán)產(chǎn)生還原性輔酶用于線粒體ATP的合成。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，在維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)中具有重要作用，能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，并具有調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝和細(xì)胞的抗氧化等功能[13]。組氨酸是一種半必需氨基酸，對(duì)嬰幼兒及動(dòng)物的成長(zhǎng)尤為重要，研究發(fā)現(xiàn)幼齡動(dòng)物和嬰兒體內(nèi)的組氨酸合成量不能滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要，這些氨基酸代謝的紊亂，直接影響到機(jī)體的正常生理功能，與IA的發(fā)病有著密切的關(guān)系。

4.2 三羧酸循環(huán)

三羧酸循環(huán)是糖、脂肪和蛋白質(zhì)在體內(nèi)徹底氧化的共同代謝途徑，也是機(jī)體質(zhì)量要的能量供應(yīng)渠道。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，本研究中檸檬酸含量顯著降低，提示IA模型大鼠三羧酸循環(huán)發(fā)生紊亂。三羧酸循環(huán)另一重要功能是為其他合成代謝提供小分子前體，例如α-酮戊二酸和草酰乙酸分別是合成谷氨酸和天冬氨酸的前體，三羧酸循環(huán)的紊亂直接導(dǎo)致機(jī)體供能的紊亂及間接影響氨基酸的合成，影響機(jī)體的正常生理功能。D-β-羥丁酸是一種酮體，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸,經(jīng)三羧酸循環(huán)代謝，當(dāng)機(jī)體代謝發(fā)生紊亂,不能正常利用葡萄糖時(shí)，心、腦等器官可利用酮體氧化分解供能，使D-β-羥丁酸含量降低，這些都說明IA的發(fā)病與三羧酸循環(huán)的紊亂有密切的關(guān)聯(lián)。

進(jìn)食高脂飲食會(huì)增高血膽酸水平[14]，IA模型大鼠血清中?；悄懰岷团；敲撗跄懰崴缴?，分析原因考慮是IA模型大鼠一直以特制高脂飼料喂養(yǎng)，而高脂飲食可能改變了腸道的膽酸代謝。同時(shí)腸道菌群與膽酸代謝又互相影響[15-16]，研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可影響腸道菌群的構(gòu)成，使甘氨膽酸向?；悄懰徂D(zhuǎn)化，以利于疏水性強(qiáng)的高脂飲食消化吸收[17]，因此，本研究觀察到IA模型組脫氧膽酸水平降低，?；悄懰崴缴邞?yīng)該是腸道菌群的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)。并且結(jié)果顯示馬尿酸在模型組代謝發(fā)生了紊亂，這些含苯基的代謝產(chǎn)物主要是腸道菌群對(duì)酚類物質(zhì)代謝產(chǎn)生的[17-19]，表明腸道菌群在IA發(fā)病過程中的發(fā)生了變化，說明IA發(fā)病過程中存在腸道菌群的紊亂。研究顯示新生兒腸道菌群缺乏或者使用廣譜抗菌藥引起的腸道菌群紊亂，均會(huì)減少腸腔內(nèi)膽紅素的還原和糞便中尿膽素樣物質(zhì)的排泄，導(dǎo)致腸腔內(nèi)未被還原的膽紅素大量進(jìn)行腸肝循環(huán)，從而影響膽紅素的動(dòng)態(tài)平衡和其在血中的水平[20]，導(dǎo)致血清中膽紅素水平升高，這和實(shí)驗(yàn)中IA模型組大鼠膽紅素升高的結(jié)果一致。這些代謝物的變化反映了IA的一些生物學(xué)特征，可以進(jìn)一步篩選作為IA的特異性標(biāo)志物，為后續(xù)研究提供一定的參考。

綜上所述，IA的發(fā)病涉及多種代謝紊亂，高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠代謝產(chǎn)物可能引起脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和能量代謝的紊亂，最終導(dǎo)致本病的發(fā)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)IA患者可能同時(shí)存在腸道菌群失調(diào)的問題，還待進(jìn)一步研究。本研究從整體水平反映了IA發(fā)病過程中內(nèi)源性小分子的代謝變化，有助于其代謝網(wǎng)絡(luò)的全面構(gòu)建及疾病發(fā)病機(jī)制的闡釋，為IA的診斷、治療以及特效藥物的開發(fā)與評(píng)價(jià)提供一定的依據(jù)。