官雁鳴 許洪琴 俞穎*

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是一種常見(jiàn)的呼吸道致病菌[1].近年來(lái),環(huán)境污染,抗生素耐藥等因素導(dǎo)致兒童呼吸道疾病頻發(fā),其中肺炎支原體的感染率也呈逐年上升的趨勢(shì)[2].兒童感染MP后,早期快速的病原學(xué)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)疾病的治療顯得至關(guān)重要.核糖核酸恒溫?cái)U(kuò)增法(SAT-RNA)是一種新興的檢測(cè)"活菌"的技術(shù).不僅具有較高的特異性和敏感度,還可對(duì)病原體進(jìn)行快速檢測(cè).目前,SAT-RNA技術(shù)已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌等病原體檢測(cè)中體現(xiàn)了較高的診斷價(jià)值[3-4].近年來(lái)SAT技術(shù)在經(jīng)過(guò)逐漸完善后也逐漸應(yīng)用于MP檢測(cè),但對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值,尚不可知.本資料通過(guò)采用回顧病例,分析SAT技術(shù)在兒童MP感染的早期實(shí)驗(yàn)室診斷,從而為臨床用藥提供新的輔助工具.

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月至2018年5月因呼吸道疾病在本院入院治療的患兒593例.其中男333例,女260例;年齡1個(gè)月至15歲.其中0~12個(gè)月(嬰兒期)67例、1~3歲(幼兒期)210例、4~6歲(學(xué)齡前期)194例、7~15歲(學(xué)齡期)122例;支氣管肺炎16例,急性扁桃體炎25例,上呼吸道感染44例,支氣管炎89例,肺炎419例;短病程(≤7d)225例和長(zhǎng)病程(>7d)368例.

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、體格檢查及輔助檢查等結(jié)果并參照《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5].

1.3 檢測(cè)方法 MP核糖核酸檢測(cè)試劑盒于上海仁度生物科技有限公司購(gòu)買.在住院當(dāng)天采集患兒咽拭子,向咽拭子棉簽中加入約1ml生理鹽水,震蕩咽拭子管,待咽拭子棉簽上的分泌物溶入生理鹽水中以后,加入等量裂解液制成待測(cè)樣本.在待測(cè)樣本中加入內(nèi)標(biāo),用磁珠法提取目標(biāo)RNA,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配置一定量的擴(kuò)增檢測(cè)液,并轉(zhuǎn)至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,其中FAM為樣本通道,HEX為內(nèi)標(biāo)通道.以42℃1min為1個(gè)循環(huán),共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán).設(shè)定閾值后分別讀取每個(gè)樣本的dt值.

1.4 結(jié)果判讀 dt≥40為陰性,dt≤35為陽(yáng)性;35≤dt≤40,則樣本重新進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)定dt≤35為陽(yáng)性,dt>35為陰性.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件.率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體RNA的總體檢出情況 593例咽拭子標(biāo)本中檢出65例陽(yáng)性,總陽(yáng)性檢出率為10.96%.

2.2 肺炎支原體RNA在不同呼吸道疾病中的檢出情況 見(jiàn)表1.

表1 肺炎支原體RNA在不同呼吸道疾病中的檢出情況(n)

2.3 肺炎支原體RNA各年齡組中的檢出情況 見(jiàn)表2.

表2 各年齡組患兒肺炎支原體RNA檢出情況(n)

2.4 不同季節(jié)肺炎支原體RNA檢出情況 見(jiàn)表3.

表3 不同季節(jié)肺炎支原體RNA檢出情況(n)

2.5 不同住院時(shí)間肺炎支原體RNA檢出率 見(jiàn)表4.

表4 不同住院時(shí)間肺炎支原體RNA檢出率(n)

3 討論

MP是一種特殊的微生物,其大小介于病毒和細(xì)菌之間,主要通過(guò)飛沫途徑傳播,侵犯人體呼吸系統(tǒng)[6],可致肺炎、急性支氣管炎等疾病[7].MP感染缺乏特異性的臨床表現(xiàn),基本與病毒感冒類似,易被誤診而延誤治療.可見(jiàn),準(zhǔn)確而又快速的檢測(cè),對(duì)于臨床診斷及治療意義重大.

目前臨床實(shí)驗(yàn)室中主流的MP檢測(cè)方法包括以培養(yǎng)技術(shù)為主的傳統(tǒng)MP培養(yǎng)法、MP快速培養(yǎng)法,還有以血清學(xué)為主的血清IgM抗體檢測(cè)技術(shù)以及以分子生物法為主的PCR技術(shù).傳統(tǒng)的MP培養(yǎng)法雖然是金標(biāo)準(zhǔn),但由于其培養(yǎng)條件嚴(yán)苛,檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng),故難以應(yīng)用于MP的早期診斷.快速培養(yǎng)法根據(jù)液體培養(yǎng)基的顏色變化來(lái)判斷結(jié)果,但易受非特異性菌干擾,所以特異性不高.血清學(xué)抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)便,但是存在窗口期的問(wèn)題.一般兒童感染肺炎支原體約1周后,血清中才能檢測(cè)出MP-IgM抗體,12周后才開(kāi)始逐漸消失,且存在年齡等因素的個(gè)體差異,因此早期診斷價(jià)值不高;PCR技術(shù)主要檢測(cè)患者局部感染灶分泌物中的DNA,具有較好的敏感度和特異性,是目前應(yīng)用于早期診斷的較好的方法,但MP -DNA持續(xù)攜帶中位數(shù)時(shí)間為7周,個(gè)別甚至長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月[8],所以無(wú)法區(qū)分正在感染還是攜帶狀態(tài).RNA-SAT作為新一代活菌檢測(cè)技術(shù),能解決上述檢測(cè)方法的問(wèn)題.因?yàn)镽NA僅存在于活菌中,因此陽(yáng)性提示正在感染,從而和既往感染區(qū)分開(kāi).此外還能縮短窗口期,避免假陽(yáng)性.另外SAT是一種無(wú)創(chuàng)檢查方法,兒童的依從性更好.

本資料發(fā)現(xiàn),呼吸道疾病患兒MP的總陽(yáng)性率約為10.96%.在MP所致疾病中,陽(yáng)性檢出率最高的是肺炎,隨后依次為為支氣管肺炎、急性上呼吸道感染等.一旦發(fā)生呼吸疾病,應(yīng)及時(shí)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè),以達(dá)到早期檢測(cè),合理用藥的目的.在不同年齡組中,學(xué)齡前和學(xué)齡兒童的檢出率較高,其主要原因在于MP感染主要見(jiàn)于>5歲的兒童,而在<5歲兒童中感染率相對(duì)較低,提示要在學(xué)齡前和學(xué)齡期兒童中做好預(yù)防保健工作.此外,低年齡組患兒取樣不成功也可能是檢出率低的原因.在對(duì)不同季節(jié)MP檢出率的統(tǒng)計(jì)中,作者發(fā)現(xiàn)秋冬季是MP檢出的高峰期,提示秋冬季是MP的好發(fā)季節(jié).在對(duì)患兒住院病程的分析中,發(fā)現(xiàn)短病程組中MP的檢出率要比長(zhǎng)病程高,這是因?yàn)镾AT技術(shù)檢測(cè)的靶標(biāo)是只存在于活菌體內(nèi)的RNA,當(dāng)病程較長(zhǎng)時(shí),RNA的活性可能會(huì)因?yàn)橛盟幥闆r、自身免疫等因素而下降,因此MP-SAT診斷MP感染時(shí)應(yīng)注意取樣時(shí)間.

綜上所述,MP-SAT技術(shù)能縮短MP檢測(cè)窗口期,可區(qū)分"正在感染"和"病菌攜帶",在兒童MP的早期診斷中有較高價(jià)值.MP感染主要發(fā)生在秋冬季節(jié),學(xué)齡前兒童和學(xué)齡兒童是易感人群.臨床醫(yī)生在懷疑MP感染時(shí),應(yīng)及早采集咽拭子送檢.