姜忠于 胡春秀 劉學武 王立 楊征奇

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的總稱,有研究顯示,CTC存在于所有腫瘤患者體內(nèi),即使原發(fā)性病灶已被切除[1].目前CTC在轉移腫瘤患者的預后評估中應用最為廣泛,尤其是惡性腫瘤患者[2].CTC存在由細胞表皮因子受體(EGFR)信號轉導通路異常所引起的EGFR表達過度及變異等可促進癌細胞增殖且抑制凋亡的生長調(diào)節(jié)異常的現(xiàn)象[3-5].近年來,隨著分子靶向藥物逐漸成為肺癌靶向治療位點的熱點研究方向[6].對于晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的靶向治療藥物目前以EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物為主[7].本資料探討CTC-EGFR表達水平對EGFR-TKIs一線治療晚期NSCLC的預后影響.現(xiàn)報道如下.

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自2017年4月至2018年3月期間由本院收治確診的晚期NSCLC患者81例,男55例,女26例;年齡35~78歲,平均(45±5.8)歲;病程1~15個月,平均(0.5±6.5)個月.本研究在醫(yī)院醫(yī)學倫理會同意下并征得所有患者及家屬同意且簽署知情同意書.納入標準:(1)NSCLC患者需經(jīng)病理組織檢查并確診EGFR突變陽性;(2)經(jīng)影像學檢查(CT或MRI)病灶大小可測量;(3)入組前從未接受過TKI類藥物治療;(4)預計生存期>3個月.排除標準:(1)不能經(jīng)組織病理檢查確診為NSCLC,EGFR野生型;(2)已使用過TKI類藥物治療;(3)合并有其它惡性腫瘤合并;(4)肝腎功能異常;(5)具有TKI類藥物嚴重不良反應.

1.2 治療方法 根據(jù)患者的經(jīng)濟情況進行用藥,36例患者服用吉非替尼250mg,1次/d;19例患者服用厄洛替尼150mg,1次/d以及26例患者服用鹽酸?？颂婺?25mg,3次/d.均持續(xù)服用1個月.TKI治療進展后腺癌采用培美曲塞或多西他賽聯(lián)合抗血管靶向藥(貝伐單抗),鱗癌采用多西他賽聯(lián)合鉑類后續(xù)治療.

1.3 外周血CTC分選及驗證 使用流式細胞分選技術.治療前隨機抽取15例患者在空腹狀態(tài)下采集肘部靜脈血20ml,使用肝素抗凝后,將其均分成20管,每管1ml.在每管中加入CD45-PC5、CK18-FITC各200μl后,避光處放置30min;再加入氯化銨(NH4Cl)溶血素4ml,反復溶血直至管中液體透亮后,進行離心后再加入培養(yǎng)液,開啟流式細胞儀進行分選.對SORT的左右進行設置,左側收集CD45-PC5細胞群,右側收集CK18-FITC細胞群.再根據(jù)要求以1500個為收集數(shù)目,同時裝配分選管,并以10000~25000個/s流速收集細胞,收集需全程震蕩.分選出的CD45-CK18+細胞用玻片最后收集微球,進行HE染色后,在光鏡下觀察細胞特征表現(xiàn).

1.4 外周血CTC-EGFR表達檢測 使用流式細胞分選技術.81例患者在TKI類藥物治療前及治療1個月后空腹狀態(tài)下采集肘部靜脈血5ml經(jīng)肝素抗凝處理后,取100μl加入有CD45-PC、5EGFR-PE和CK18-FITC各20μl的5ml無菌試管中,搖勻,在室溫下避光處放置30min;再加入NH4Cl溶血素進行溶血處理,15min后上流式細胞儀同時檢測外周血CTCEGFR表達.用外周血CTC-EGFR表達的中位數(shù)為界值,EGFR表達的中位數(shù)為52.6%將大于中位數(shù)的定為EGFR高表達,低于中位數(shù)則為EGFR低表達.

1.5 療效評價及隨訪觀察 (1)療效評價:參照RECIST1.1標準對患者進行抗癌治療1個月后的療效進行區(qū)別劃分,即所有目標病灶消失且所有淋巴結直徑減小至<10mm為完全緩解(CR)、目標病灶短直徑和減少>30%為部分緩解(PR)、目標病灶短直徑之和增加>20%或出現(xiàn)新病灶為疾病進展(PD)、目標病灶短直徑之和減小程度未達到PR或是增加程度未達PD則為疾病穩(wěn)定(SD);其中治療有效率(RR)以CR+PR表示,疾病控制率(DCR)則用CR+PR+SD表示.(2)預后情況觀察:完成治療后隨訪2年,記錄所有患者的無進展生存期(PFS)、總生存期(OS)以及2年的生存率.并對EGFR高表達者和低表達者的RR、DCR、中位PFS、中位OS以及2年生存率進行比較.1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件.計量資料以(±s)表示,組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;PFS、生存率采用Kaplan-Meier方法中Log-Rank檢驗.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 外周血CTC驗證 染色后的CD45-CK18+細胞通過光鏡可觀察到細胞核顏色加深、染色質(zhì)變粗及細胞核質(zhì)比增大等現(xiàn)象,即惡性腫瘤細胞特征現(xiàn)象,從而證實CD45-CK18+細胞是外周血CTC.

2.2 病理檢查 病理分型為腺癌73例,鱗癌8例;TNM分期為Ⅲb期6例和Ⅳ期75例;功能狀態(tài)(ps)評分為0~1分54例以及≥2分27例.

2.3 EGFR高表達和低表達者比較 81例晚期NSCLC中,EGFR表達的中位數(shù)為52.6%.治療前EGFR高表達者和低表達者分別為35例和46例,治療1個月后的EGFR高表達者和低表達者分別為39例和42例.EGFR高表達者有效率(74.1%)顯著高于低表達者(23.8%),P<0.05;EGFR高表達者控制率(89.7%)顯著高于低表達者(40.5%),P<0.05.EGFR高表達與低表達者的療效評價見表1.

表1 治療1個月末療效情況及EGFR表達情況觀察[n(%)]

2.4 EGFR高表達者和低表達者預后比較 由表2可知EGFR高表達者中位PFS、中位OS及2年生存率均高于低表達者(P均<0.05).隨訪2年中EGFR高表達者和低表達者死亡數(shù)分別是22例、30例.

表2 EGFR高表達者和低表達者預后比較

3 討論

臨床檢測EGFR突變情況的方法較多,但均需依賴組織標本進行檢測.目前以手術切除或穿刺活檢的肺癌組織作為檢測標本是NSCLC患者進行EGFR基因突變檢測的主要方法,但此時患者的診斷多處于早期,或是中晚期且尚未進行靶向治療,而晚期手術患者又難以獲得足量標本.因而晚期NSCLC患者雖然可從TKIs藥物靶向治療中獲益,但因缺乏簡單方便的臨床檢測方法而導致在制訂使用TKIs類藥物的治療方案時,缺乏確定性證據(jù).若患者的臨床治療方案不適用,則影響生存時間,甚至涉及疾病發(fā)展.而如何利用CTC-EGFR從組織標本獲取量不足的患者中篩選出適宜TKI靶向治療患者是臨床醫(yī)生目前所需解決的重要問題.

外周血CTC-EGFR的表達情況依據(jù)其表達的中位數(shù)作區(qū)分點,將其分為EGFR高表達和低表達兩種情況,本次研究在治療前后的比較中發(fā)現(xiàn),治療后1個月EGFR高表達例數(shù)有所降低,提示EGFR的表達同TKI類藥物的使用可能有某種相關性.進一步研究發(fā)現(xiàn),晚期NSCLC患者中EGFR高表達者的RR和DCR均顯著高于低表達者.說明應用TKIs類藥物進行靶向治療時EGFR高表達者的臨床療效明顯優(yōu)于EGFR表達者,提示晚期NSCLC患者可通過檢測外周血CTCEGFR的表達水平來判斷在臨床上是否進行TKIs類藥物治療,這是一種對于無法獲取足量組織標本進行EGFR突變檢測患者的有效補充.同時,對于晚期NSCLC且進行一線化療的患者,因生存期較短,使用的化療方案需盡可能確保病灶被有效控制,臨床治療中不需花費過多的時間在化療方案的調(diào)整上.此外,本研究結果表示,在中位PFS、中位OS及2年生存率的比較中EGFR高表達者均顯著高于EGFR低表達者,表明EGFR高表達的晚期NSCLC患者經(jīng)TKI類藥物靶向治療后具有更好的預后.進一步說明對于EGFR高表達的一線晚期NSCLC患者,基本確定了使用TKI類藥物有更好的預后,化療方案無需進行試驗性使用,減少因化療方案選擇不當引起的時間浪費.

綜上所述,外周血CTC-EGFR高表達的一線晚期NSCLC患者使用TKI靶向治療的效果及預后均比EGFR低表達者強.提示采用TKI靶向治療的晚期NSCLC患者可通過檢測外周血CTC-EGFRDE 表達水平來篩選,提高患者臨床治療效果.