張梁宇 單浩 朱曉楊 孫穎 陳楊

銀屑病是一種常見的皮膚自身免疫性疾病,影響了約3%的世界人口,對(duì)全球>3%人群的生活質(zhì)量產(chǎn)生了重大的負(fù)面影響[1-2].其特點(diǎn)是角質(zhì)化細(xì)胞的增殖和異常分化,以及淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤[3].遺傳、免疫、傳染性和代謝紊亂都是銀屑病的病因[4].然而,銀屑病的確切發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚.通過尋找特征性生物標(biāo)記物,準(zhǔn)確地預(yù)測疾病的進(jìn)展和治療效果是目前銀屑病研究的熱點(diǎn)[5].微小RNA(microRNA)是種由高度保守的小非編碼RNA組成的大家庭,其通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)不同的生物過程.有研究提示,miR表達(dá)異常在一些皮膚病(如銀屑病、狼瘡等)疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6].一些與銀屑相關(guān)的miR被認(rèn)為是導(dǎo)致銀屑病的發(fā)展的原因,運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)檢測銀屑病血清中miR的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR多個(gè)在銀屑病的皮膚上有2~42倍的差異[7].通過使用生物信息學(xué)方法,作者發(fā)現(xiàn)miR-146a和miR-125b在銀屑病患者血清中表達(dá)水平發(fā)生了顯著差異.基于上述發(fā)現(xiàn),本研究檢測銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表達(dá)水平,并進(jìn)一步評(píng)估了銀屑病的臨床嚴(yán)重程度,為尋找銀屑病病情嚴(yán)重程度及療效評(píng)估潛在的生物學(xué)標(biāo)志物提供依據(jù).

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年6月至2018年6月在本院皮膚科就診的門診和住院尋常型銀屑病患者72例作為銀屑病組,男39例,女33例,平均年齡(38.22±8.41)歲.其中進(jìn)行期27例、靜止期22例、退行期23例.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者符合《中國銀屑病治療專家共識(shí)(2014版)》中尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)所有患者近2個(gè)月未接受系統(tǒng)治療;(3)沒有使用免疫抑制劑、維A酸和糖皮質(zhì)激素等藥物治療;(4)所有患者及(或)家屬對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書.排除標(biāo)準(zhǔn):(1)銀屑病合并其他免疫系統(tǒng)疾病患者;(2)不能配合檢測患者;(3)患有嚴(yán)重肝、腎、心疾病患者.同時(shí)選擇本院同期進(jìn)行健康體檢者70例作為對(duì)照組,男36例,女34例,平均年齡(35.57±4.67)歲.兩組觀察對(duì)象臨床資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性.本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn).

1.2 銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評(píng)分法(PASI)評(píng)分[9]皮損嚴(yán)重程度為紅斑(E)、鱗屑(D)和浸潤程度(I)的評(píng)分相加,上述病變按輕、中、重、極重度分別記1~4分,沒有病變記為0分.根據(jù)身體各部位皮損面積評(píng)分計(jì)數(shù)PASI,PASI=頭部積分X(E+D+I)X0.1+上肢積分X(E+D+I)X0.2+軀干X(E+D+I)X0.3+下肢積分X(E+D+I)X0.4,各癥狀積分除以2,總分為72分.所有患者由具有高年資醫(yī)生進(jìn)行PASI評(píng)定.

1.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(RTFQ-PCR)法檢測血清中miR-146a和miR-125b的水平 采集清晨空腹靜脈血5ml,加入TRIzol 1ml后-80℃保存,備用;取出保存的加TRIzol全血,根據(jù)RNA提取試劑盒(美國Life Technologies公司)操作說明書提取RNA,根據(jù)Taq Man microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)說明合成cDNA,將cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM II熒光定量PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增.miR-146a引物序列:上游引物為5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3',下游引物為5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3';miR-125b引 物 序 列:上 游 引 物 為5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3',下游引物為5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3';GAPDH引物序列:上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3,下游引物為5-GGTATCCATCGCCATGCTC -3'.每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析,以GADPH作為內(nèi)參,采用 2-△△Ct法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量.

1.4 miR微陣列分析 從所合成的cDNA中隨機(jī)選擇銀屑病組和對(duì)照組各4例進(jìn)行miR微陣列分析.將cDNA進(jìn)行poly A加尾Mix和進(jìn)行生物素標(biāo)記,然后雜交至芯片上,進(jìn)行清洗和染色后用Affymetrix掃描儀3000掃描陣列,使用GeneChip miRNA2.0陣列檢測miR的表達(dá).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件.計(jì)量資料以(±s)表示,分析前進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn),若滿足正態(tài)性,用單因素方差分析進(jìn)行判斷;若不滿足正態(tài)性,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析.采用pearson進(jìn)行miR-146a和miR-125b與PASI相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 銀屑病組和對(duì)照組之間miR表達(dá)差異 對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行miR微陣列分析(銀屑病組和對(duì)照組各4個(gè)),銀屑病患者中發(fā)現(xiàn)39個(gè)miR表達(dá)水平顯著不同,其中26個(gè)miR表達(dá)上調(diào),13個(gè)表達(dá)下調(diào).

2.2 兩組觀察對(duì)象血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較 見表1.

表1 兩組觀察對(duì)象血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較(±s)

表1 兩組觀察對(duì)象血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較(±s)

分組 miR-146a miR-125b銀屑病組(n=72) 5.74±0.07 0.35±0.04對(duì)照組(n=70) 1.00±0.09 1.00±0.02 t值 54.779 65.658 P值 0.000 0.000

2.3 不同程度銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較 見表2.

表2 不同程度銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較(±s)

表2 不同程度銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平的比較(±s)

注:與進(jìn)行期比較,*P<0.05;與靜止期比較,#P<0.05

分組 miR-146a miR-125b進(jìn)行期(n=27) 1.00±0.10 1.00±0.07靜止期(n=22) 0.53±0.09* 2.48±0.07*退行期(n=23) 0.20±0.07*# 4.55±0.12*#F值 127.650 286.560 P值 0.000 0.000

2.4 銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表達(dá)水平與PASI評(píng)分相關(guān)性分析 經(jīng)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,用pearson線性相關(guān)進(jìn)行分析,銀屑病患者PASI評(píng)分與血清中miR-146a的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.510,P=0.026);銀屑病患者PASI評(píng)分與血清中miR-125b的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.417,P=0.038).見表3.

表3 銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表達(dá)水平與PASI評(píng)分相關(guān)性分析(n=72)

3 討論

近年來,許多研究集中在miR與各種人類疾病的發(fā)展之間的關(guān)系,包括皮膚病.銀屑病是成人的慢性炎性皮膚病,然而難以治療和評(píng)估.既往對(duì)銀屑病的研究主要以皮膚作為標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測,但皮膚受到取材部位的代表性和患者的接受意愿等問題,受到一定的限制[10].而在對(duì)miR-369-3p的研究發(fā)現(xiàn),患者血清和皮膚樣本中miR-369-3p水平無顯著相關(guān)性,這可能是由于miR-369-3p不僅從銀屑病灶的角化細(xì)胞和炎性細(xì)胞分泌,而且外周血單核細(xì)胞也能分泌有關(guān)[11].因此,本研究采用血清作為研究標(biāo)本,對(duì)銀屑病患者和健康對(duì)照者中miR-146a和miR-125b mRNA表達(dá)進(jìn)行了綜合分析.

既往研究通過對(duì)miR表達(dá)系統(tǒng)分析,證實(shí)了銀屑病皮膚中存在大量調(diào)控失調(diào)的miRNA[12].在銀屑病患者中,miR-203的過表達(dá)可能通過抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子3(SOCS-3)的抑制因子而增加皮膚炎癥反應(yīng).miR-146a和miR-125b已參與調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng),miR-146a表達(dá)上調(diào)能夠抑制TNF-α信號(hào)通路,調(diào)節(jié)靶基因TRAF6和IRAK1的表達(dá).與之相反,miR-125b表達(dá)下調(diào)可能增強(qiáng)TNF-α的表達(dá),促進(jìn)皮膚炎癥的發(fā)展.Pivarcisi等[13]研究發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組比較,銀屑病患者血清中miR-128a、miR-142-3p、miR-181a和let-7d表達(dá)下調(diào),miR- 223和miR- 143顯著上調(diào).本研究進(jìn)行miR微陣列分析發(fā)現(xiàn),銀屑病患者中39個(gè)miR表達(dá)水平顯著不同,其中26個(gè)miR表達(dá)上調(diào),13個(gè)表達(dá)下調(diào).在39種失調(diào)的miR中,有幾種miR被報(bào)道與銀屑病或其他炎癥性疾病的失調(diào).例如,銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-31上調(diào),通過靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)[14];在銀屑病皮膚中miR-99a和miR-200c下調(diào),miR-99a可以通過上調(diào)IGF-1R的表達(dá)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化[15];miR-192上調(diào)抑制巨噬細(xì)胞,使MIP-2α表達(dá)下降,MIP-2α參與腸道炎癥疾病的發(fā)展.本研究結(jié)果顯示,銀屑病組血清中miR-146a表達(dá)增高,miR-125b表達(dá)降低,且隨著銀屑病病情的好轉(zhuǎn),miR-146a下調(diào)和miR-125b上調(diào)幅度更顯著.本研究不僅調(diào)查了銀屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表達(dá)的水平,還評(píng)估了它們與患者PASI評(píng)分的相關(guān)性.結(jié)果顯示,銀屑病患者PASI評(píng)分與血清中miR-146a的表達(dá)水平呈正相關(guān),與miR-125b的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān).因此,將血清中miR-146a和miR-125b作為診斷銀屑病的潛在標(biāo)志物是合理的.本研究也通過生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)綜述,發(fā)現(xiàn)7個(gè)與銀屑病相關(guān)基因被預(yù)測為miR-146a和miR-125b的靶基因,包括TNF-α、LIMK1、SIRT1、SP3、ADAM10、hes1和 WNT5A.其中,TNF-α被報(bào)道為直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞的重要致病性細(xì)胞動(dòng)力學(xué)因子,誘導(dǎo)多種趨化因子的產(chǎn)生,并參與白細(xì)胞介素介導(dǎo)進(jìn)入銀屑病病變.由于本研究設(shè)計(jì)初始階段無法確定與銀屑病相關(guān)的miR,因此無法對(duì)靶基因水平進(jìn)行檢測,導(dǎo)致靶基因?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)的缺失,使本研究的結(jié)果推廣受到限制,后續(xù)將完善相關(guān)研究.

綜上所述,銀屑病血清中miR-146a水平升高、miR-125b水平降低,且二者的表達(dá)水平與銀屑病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),有可能作為判斷銀屑病病情嚴(yán)重程度及療效評(píng)估潛在的生物學(xué)標(biāo)志物.由于本研究樣本量和代表性等的局限性,同時(shí)未對(duì)miR-146a和miR-125b的靶基因進(jìn)行研究,其結(jié)果推廣應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究.