徐建飛，汪洋，胡旭軍，王婳，許兆軍

（中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 寧波 315010）

由天然活性產(chǎn)物衍生的新型抗炎藥的發(fā)現(xiàn)引起了醫(yī)藥化學(xué)家的廣泛關(guān)注。土木香內(nèi)酯（alantolactone，ALA）是從土木香根莖中提取的，在古代被用作中草藥。它是萜類不飽和化合物中最重要的一類，被認(rèn)為是治療神經(jīng)損傷、癌癥和胰島素抵抗等多種疾病的候選藥物[1-3]。最近的研究表明，ALA具有多種抗炎和抗腫瘤藥理活性[4-5]。另外，在大鼠外傷性腦損傷中，ALA表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)的作用[3]。不僅如此，ALA可保護(hù)Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，并逆轉(zhuǎn)了東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙，進(jìn)一步的研究表明活性氧簇參與其中[6]。但是ALA對過度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體作用及其機(jī)制仍不清晰。為探討ALA抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，我們以神經(jīng)細(xì)胞PC12 為對象，觀察其對H2O2引起的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡的抑制作用并初步探討機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。ALA購自上海陶素生化科技有限公司；H2O2購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗體兔IgG/鼠IgG購自美國Santa Cruz公司；抗GAPDH兔單克隆抗體、AMPK鼠單克隆抗體、p-AMPK鼠單克隆抗體、STAT1兔多克隆抗體和p-STAT1兔單克隆抗體購自美國CST公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)細(xì)胞PC12 培養(yǎng)：將PC12 細(xì)胞接種到DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 μ/mL鏈霉素、100 μ/mL青霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)，每48 h換液1次，2～3 d傳代1次，傳代2次取生長良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況：分別取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入1、5、10、20、50和100 μmol/L的ALA，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；分別取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入1、5 μmol/L的ALA提前孵育1 h后，加入H2O2處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 或48 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后小心吸盡上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混勻，采用酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3 分組：①將PC12 細(xì)胞分組，設(shè)立正常組、H2O2（100 μmol/L）組、ALA（1、5 μmol/L）組，ALA孵育細(xì)胞1 h后再經(jīng)H2O2處理24 h、48 h，分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)和收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)；②將PC12細(xì)胞分組，設(shè)立對照組、H2O2（100 μmol/L）組、siAMPK組、H2O2+siAMPK組、H2O2+siAMPK+ALA（5 μmol/L）組，PC12細(xì)胞經(jīng)AMPK的siRNA（10 nmol/L）處理細(xì)胞24 h后再經(jīng)ALA孵育1 h，最后用H2O2處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞AMPK、STAT1、p-AMPK和p-STAT1的表達(dá)：細(xì)胞裂解后，測蛋白濃度并配平每個(gè)蛋白的上樣量。等量蛋白通過SDS膠進(jìn)行分級分離，然后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，相對分子質(zhì)量小的用0.2 μm孔徑的膜，相對分子質(zhì)量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，待封閉好后加入一抗（AMPK鼠單克隆抗體、p-AMPK鼠單克隆抗體、STAT1兔多克隆抗體、p-STAT1兔單克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，稀釋均為1:1 000），置室溫?fù)u床孵育2 h之后移至4 ℃搖床過夜。次日加入HRP結(jié)合的二抗（1:3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光儀成像。

1.2.5 siRNA誘導(dǎo)的基因沉默：利用特異性siRNA序列實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的基因沉默，大鼠AMPK特異性siRNA購買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。采LipofectamineTM2 000（美國Invitrogen公司）將10 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，具體操作根據(jù)說明書指示進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用Student's t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低劑量ALA不影響PC12細(xì)胞增殖 不同濃度ALA（1、5、10、20、50和100 μmol/L）處理神經(jīng)細(xì)胞PC12 24 h后，MTT法檢測各濃度對PC12細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20 μmol/L及以上濃度的ALA可明顯抑制PC12細(xì)胞增殖（P＜0.05），見圖1。表明高濃度ALA對PC12細(xì)胞有著細(xì)胞毒性作用，可能會影響后續(xù)研究，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)只使用1和5 μmol/L濃度的ALA。

2.2 ALA劑量依賴性抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞凋亡細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在H2O2（100 μmol/L）處理24或48 h條件下，與正常組比，H2O2組PC12細(xì)胞凋亡明顯上升（P＜0.01），經(jīng)ALA處理后，PC12細(xì)胞凋亡得到顯著改善，且ALA濃度越高，改善效果越好，見圖2A-B。類似的結(jié)果可以在流式實(shí)驗(yàn)中觀察到，見圖2C。表明ALA可緩解H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

圖1 MTT法檢測不同濃度ALA對PC12細(xì)胞增殖的影響

2.3 ALA抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞STAT1磷酸化

為探究ALA緩解H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，檢測細(xì)胞凋亡密切相關(guān)蛋白STAT1的磷酸化以及細(xì)胞能量代謝調(diào)控蛋白AMPK的磷酸化情況。經(jīng)H2O2處理后STAT1的磷酸化水平明顯增高，而1和5 μmol/L ALA預(yù)處理顯著降低STAT1的磷酸化（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量越高，抑制效果越明顯的趨勢（P＜0.05），見圖3A。ALA組AMPK的磷酸化水平明顯上升，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖3B。表明AMPK/STAT1可能參與ALA緩解H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

圖2 ALA抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

2.4 ALA通過激活A(yù)MPK降低STAT1磷酸化緩解H2O2引起的PC12細(xì)胞凋亡 利用siRNA沉默AMPK的表達(dá)后，再用ALA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默AMPK后，ALA無法降低H2O2誘導(dǎo)的STAT1磷酸化，ALA+siAMPK+H2O2組與siAMPK+H2O2組STAT1磷酸化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4A-C；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默AMPK可逆轉(zhuǎn)ALA的抗凋亡作用，見圖4D。表明ALA可能通過激活A(yù)MPK降低STAT1磷酸化，從而緩解抑制H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12的凋亡。

3 討論

在腦缺血性疾病中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是重要的病理進(jìn)程。近年研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾小時(shí)內(nèi)，經(jīng)一系列生化級聯(lián)反應(yīng)引起神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致相應(yīng)缺血腦區(qū)功能障礙從而引起一系列缺血癥狀，嚴(yán)重危害人類健康[7]。因此腦缺血后保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及尋找抗凋亡靶點(diǎn)成為現(xiàn)今抗腦缺血研究熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)ALA具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，并且發(fā)現(xiàn)其作用是基于對AMPK/STAT1通路的調(diào)控。

圖3 ALA對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞STAT1（A）和AMPK（B）磷酸化的影響

圖4 ALA通過AMPK調(diào)控H2O2誘導(dǎo)PC12的STAT1磷酸化和細(xì)胞凋亡

ALA作為中藥土木香的主要成分，有研究報(bào)道其具有良好的抗腫瘤效果[4，8-9]；更有研究顯示ALA可緩解胰島素抵抗，治療外傷性神經(jīng)損傷和多種炎癥性疾病[1-2，5，10]。在研究ALA對H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡的作用時(shí)，本研究首先使用了經(jīng)典的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)，檢測了不同濃度的ALA對PC12產(chǎn)生的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較低劑量時(shí)（1、5和10 μmol/L），ALA組與對照組MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果無差異；而當(dāng)濃度增加到20 μmol/L時(shí)，ALA便顯示出明顯的細(xì)胞毒性作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取了較低濃度的ALA（1和5 μmol/L）做進(jìn)一步的研究。

AMPK是細(xì)胞發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等過程[11]。STAT1被發(fā)現(xiàn)是AMPK調(diào)控炎癥的重要蛋白，其使得生物能量學(xué)與細(xì)胞炎癥聯(lián)系起來[12]。除此之外，JAK/STAT1作為在缺血性再灌注中起著介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用[13]；不僅如此，更多文獻(xiàn)報(bào)道其與細(xì)胞凋亡有著緊密聯(lián)系[14]。本研究主要探究ALA對H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡的作用。本研究采用了細(xì)胞流式和MTT的方法檢測了不同濃度ALA對H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡的影響。結(jié)果表明：與對照組比，ALA可明顯減少H2O2誘導(dǎo)PC12的凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。另外，AMPK與STAT1作為一種重要的細(xì)胞信號通路可調(diào)控細(xì)胞炎癥信號。本研究也對其進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與H2O2組相比，ALA可明顯增強(qiáng)PC12細(xì)胞AMPK的激活，同時(shí)STAT1在H2O2處理后有明顯的激活，而ALA再處理后，STAT1的磷酸化有著顯著下調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。另siAMPK轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明：siAMPK可逆轉(zhuǎn)ALA對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的p-STAT1抑制作用和抗凋亡作用，說明抑制STAT1的磷酸化的表達(dá)后ALA無法實(shí)現(xiàn)對STAT1的調(diào)控作用。

綜上所述，神經(jīng)細(xì)胞PC12受H2O2干預(yù)后，STAT1被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ALA處理后，可顯著激活A(yù)MPK，同時(shí)降低了H2O2誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化表達(dá)和細(xì)胞凋亡。而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALA對STAT1的調(diào)控作用是通過激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)。然而我們的研究僅在細(xì)胞層面闡明了ALA通過調(diào)控AMPK/STAT1起著神經(jīng)保護(hù)作用，但未能在動(dòng)物層面論證其抗凋亡作用及對認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用。在后續(xù)研究中，我們將深入探究ALA對腦損傷的保護(hù)作用。