鄭文文，張杭，周心禾，洪瑩，莊飛，吳宸煒，陳霞，何航輝，蘇悅，鄭超

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325027）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種受多基因遺傳和多種環(huán)境因素影響的代謝障礙性疾病。抵抗素（resistin，RETN）、瘦素受體（leptin receptor，LEPR）和脂聯(lián)素（adiponectin，ADIPOQ）是目前發(fā)現(xiàn)的主要脂肪細(xì)胞因子，在肥胖、胰島素抵抗及T2DM中發(fā)揮重要作用[1-2]。本研究擬通過(guò)探討中國(guó)浙江地區(qū)漢族人群中T2DM患者與對(duì)照者之間RETN（rs1862513、rs3745367），LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）各位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的差異，以及RETN、LEPR和ADIPOQ基因多態(tài)性與血脂代謝的關(guān)系，為T(mén)2DM的早期預(yù)測(cè)、診斷、治療及預(yù)后提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 T2DM組526例，男286例，女240例，均來(lái)自2018年9月至10月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院就診患者，診斷均符合1999年WHO糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除1型糖尿病和特殊類(lèi)型糖尿?。粺o(wú)糖尿病正常對(duì)照組344例，男189例，女155例，均來(lái)自同期在我院體檢中心體檢的健康人群，空腹血糖（fasting plasma sugar，F(xiàn)PG）低于6.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）低于6.0%，無(wú)糖尿病家族史。所有研究對(duì)象彼此間無(wú)親緣關(guān)系。該研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 臨床及生化檢測(cè) 記錄患者年齡、性別，測(cè)量身高、體質(zhì)量，計(jì)算BMI。抽取靜脈血檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，HbA1c由高效液相色譜法測(cè)定，F(xiàn)PG由葡萄糖氧化酶法測(cè)定，甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）由酶法測(cè)定，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL）用直接法測(cè)定。

1.3 基因組DNA提取及測(cè)序分型

1.3.1 提取全基因組DNA：取3 mL外周空腹靜脈血，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝。嚴(yán)格按照DNeasy血液/組織基因組DNA提取試劑盒（美國(guó)Qiagen公司）說(shuō)明書(shū)提取全基因組DNA。應(yīng)用Nano-Drop-1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)DNA濃度和純度，稀釋至約10 ng/μL后置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測(cè)RETN、LEPR和ADIPOQ基因多態(tài)性：采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術(shù)，自動(dòng)化設(shè)計(jì)SNP分型的等位基因特異性引物和通用反向引物，引物序列見(jiàn)表1，由北京一道生物科技有限公司合成。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：①DNA質(zhì)檢和濃度測(cè)定：取1 μL置于百泰克ND5000超微紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量，質(zhì)檢合格后的DNA樣本方可進(jìn)行后續(xù)的分型實(shí)驗(yàn)，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：DNA濃度＞20 ng/μL，純度OD260/OD280=1.6～2.0。②DNA均一化處理：質(zhì)檢合格的DNA進(jìn)行稀釋?zhuān)K濃度是5 ng/μL。③PCR反應(yīng)：取2 μL DNA，在55 ℃ 45 min烘干，然后配置混合物（mix），3 μL體系，需要2×KASP master mix（北京梓熙生物科技有限公司）及引物mix，mix由濃度是100 pmol/μL的F1:F2:R=1:1:2.5的比例混合，引物mix占反應(yīng)體系的1/72。④參比熒光檢測(cè)：PCR反應(yīng)體系配好以后，在ABI 7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行預(yù)讀，然后在ABI 9700 PCR儀再進(jìn)行PCR反應(yīng)，94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 1 min，共10個(gè)循環(huán)，降落PCR每次降落0.6 ℃；94 ℃ 20 s，55 ℃ 1 min，共26個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 1 min。⑤終熒光檢測(cè)：PCR完成后，在ABI 7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行后讀出，通過(guò)SDS2.4進(jìn)行基因分型和判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；蛐头植甲鱄ardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；2組等位基因頻率和基因型頻率比較采用χ2檢驗(yàn)；OR 采用成組比較法（病例對(duì)照研究）比較，以95%CI 表示，采用非條件logistic回歸分析校正年齡、性別、BMI；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料中符合正態(tài)分布，采用表示，不符合正態(tài)分布，采用M（P25，P75）表示；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，2組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用非參數(shù)分析中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，采用線性回歸分析校正年齡、性別、BMI、是否使用降脂藥。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RETN、LEPR和ADIPOQ基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 T2DM組與對(duì)照組臨床資料及生化指標(biāo)比較T2DM組與對(duì)照組在性別、TG、HDL、LDL方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；T2DM組的年齡、使用降脂藥患者比例及BMI、FPG、HbA1c、TC水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.2 T2DM組與對(duì)照組基因多態(tài)性分布比較

2.2.1 RETN、LEPR、ADIPOQ基因各SNP位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)：本研究共選取了RETN基因2個(gè)SNP位點(diǎn)，LEPR基因3個(gè)SNP位點(diǎn)，ADIPOQ基因2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為：rs1862513、rs3745367、rs1137101、rs13306519、rs1805096、rs1501299、rs2241766。本研究對(duì)對(duì)照組中的這3個(gè)候選基因共7個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，7個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.056、0.817、0.753、0.307、0.562、0.141、0.986），表明樣本具有群體代表性。

2.2.2 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性的基因型和等位基因頻率分布：RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型和等位基因頻率在T2DM組與對(duì)照組中的分布見(jiàn)表3。結(jié)果經(jīng)校正年齡、性別、BMI后表明，T2DM組中RETN rs1862513基因型（GG）和變異等位基因（G）的頻率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（42.0% vs.30.0%，P=0.003；65.0% vs.57.1%，P=0.001，OR=1.397，95%CI=1.140～1.712）。

2.2.3 不同BMI下的RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性在T2DM組和對(duì)照組中的基因型頻率分布：T2DM組與對(duì)照組的RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型頻率分別在BMI＜25 kg/m2和BMI≥25 kg/m2中的分布見(jiàn)表4。結(jié)果經(jīng)校正年齡、性別、BMI后表明，BMI＜25 kg/m2時(shí)，T2DM組中RETN rs1862513基因型（GG）的頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（42.8% vs.31.0%，P=0.015）。

2.3 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性的基因型與血脂之間的關(guān)系 在總研究人群中以及不同BMI下，RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型與血脂之間的關(guān)系見(jiàn)表5。結(jié)果經(jīng)校正年齡、性別、BMI以及是否使用降脂藥后表明，BMI＜25 kg/m2時(shí)，RETN rs3745367基因型與HDL水平明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014），GG或AG基因型相較于AA基因型，HDL水平顯著降低；LEPR rs13306519基因型在BMI≥25 kg/m2時(shí)，與HDL水平顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），CC或CG基因型的HDL水平顯著低于GG基因型；在總研究人群中，ADIPOQ rs1501299基因型與TG水平顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044），CC或AC基因型的TG水平顯著高于AA基因型。

表2 T2DM組與對(duì)照組的臨床特征比較

表3 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性的基因型和等位基因頻率在T2DM組與對(duì)照組中的分布比較

3 討論

脂肪細(xì)胞因子是由脂肪組織分泌的生物活性分

子，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎性因子等，可以調(diào)節(jié)脂肪組織的分化，影響葡萄糖和脂肪酸代謝。其中糖尿病相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子是指一種與葡萄糖和血脂代謝有關(guān)的內(nèi)生信號(hào)分子，可以干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使胰島素作用的靶組織如肝臟、肌肉以及脂肪組織產(chǎn)生胰島素抵抗。RETN、LEPR和ADIPOQ是主要的糖尿病相關(guān)脂肪細(xì)胞因子，在肥胖、血脂代謝、胰島素抵抗和T2DM中起著重要作用[3-14]。它們分別由RETN、LEPR、ADIPOQ基因編碼，多項(xiàng)研究均有發(fā)現(xiàn)這3種基因存在T2DM、代謝綜合征和肥胖癥的易感位點(diǎn)[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)漢族人群中攜帶RETN rs1862513 G等位基因能顯著增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而B(niǎo)OUCHARD等[19]關(guān)于高加索人群的研究未發(fā)現(xiàn)RETN rs1862513與T2DM風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性；MA等[20]未在高加索人群中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與T2DM風(fēng)險(xiǎn)有明顯關(guān)聯(lián)。但是，在有關(guān)亞洲人群的研究中，OSAWA等[21]研究表明在T2DM患者中RETN rs1862513的GG基因型頻率顯著增加了30%；OCHI等[22]也發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的GG基因型會(huì)顯著增加年輕人的T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，以上研究表明關(guān)于T2DM與RETN rs1862513之間的關(guān)系可能與研究對(duì)象的遺傳背景和種族差異密切相關(guān)，且RETN rs1862513增加T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能在亞洲人群中更多見(jiàn)。進(jìn)一步對(duì)BMI分層分析后發(fā)現(xiàn)，RETN rs1862513與低BMI的T2DM顯著相關(guān)。但現(xiàn)有研究表明RETN是通過(guò)胰島素抵抗來(lái)增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。這與本研究結(jié)果不同，原因可能有以下幾點(diǎn)：①在糖尿病的起源和胰島素抵抗中，RETN的實(shí)際生物作用仍然存在爭(zhēng)議，尚需進(jìn)一步研究闡明；②本研究樣本量小，特別是按照BMI進(jìn)行亞組分析時(shí)，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效能下降，從而可能造成結(jié)果的差異性；③本研究為橫斷面研究，可能存在諸如信息偏差和選擇偏差等偏倚而導(dǎo)致結(jié)果的差異性。

表4 不同BMI情況下RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性的基因型頻率在T2DM組與對(duì)照組中的分布比較

表5 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態(tài)性的基因型與血脂之間的關(guān)系

RETN、LEPR和ADIPOQ這3種脂肪細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起著重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)RETN rs3745367的GG或AG基因型在BMI＜25 kg/m2中具有更低的HDL水平；LEPR rs13306519的CC或CG基因型在BMI≥25 kg/m2中與較低的HDL水平明顯相關(guān)；ADIPOQ rs1501299的CC或CA基因型在總研究人群中具有更高的TG水平。ZHOU等[24]發(fā)現(xiàn)攜帶RETN rs34861192 G等位基因與較高的TC水平明顯相關(guān)；BECER等[25]研究表明LEPR rs1137101的GG基因型在非肥胖人群中具有更高的TC及LDL水平，在肥胖人群中則具有更高的TG水平；TURECK等[26]研究發(fā)現(xiàn)ADIPOQ rs1501299的TT等位基因具有更高的TC和LDL水平。本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs位點(diǎn)與血脂的關(guān)系和以往的報(bào)道不同，補(bǔ)充了以往的研究。以上研究表明RETN、LEPR、ADIPOQ基因變異會(huì)影響機(jī)體的血脂代謝，可能因此導(dǎo)致代謝綜合征、肥胖以及糖尿病的發(fā)生，這也部分解釋了臨床上T2DM體型較胖，且多表現(xiàn)為腹型肥胖或內(nèi)臟肥胖。

綜上所述，本研究對(duì)主要脂肪因子的相關(guān)基因多態(tài)性與T2DM以及血脂的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)RETN rs1862513與中國(guó)漢族人群T2DM的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。RETN rs3745367、LEPR rs13306519和ADIPOQ rs1501299與血脂存在一定相關(guān)性，提示這些基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝等途徑參與T2DM的發(fā)生發(fā)展。鑒于本研究為橫斷面且樣本容量相對(duì)較小，有待更深入地對(duì)脂肪因子相關(guān)基因與T2DM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和致病機(jī)制進(jìn)行研究。