潘達，胡飛虹，金燦，聞浩，孟偉陽，朱烈烈，陳大慶

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027；1.急診醫(yī)學(xué)科；2.脊柱外科）

內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）在調(diào)節(jié)血管功能、生理和病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷是誘發(fā)腦卒中、動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病等心血管疾病的一個重要因素[1-2]。因此，尋找能夠?qū)够钚匝跻鸬难趸瘧?yīng)激和細胞凋亡、可治療動脈粥樣硬化的自由基清除劑具有重要臨床意義。芍藥醇（paeonol，PAE）是一種從中藥中分離出來的活性化合物，如牡丹皮、芍藥和日本薯。PAE既可用作食品添加劑又可用作傳統(tǒng)的東方藥物[3-5]，用于治療各種疾病，包括炎性疾病和動脈粥樣硬化[6]。PAE生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究顯示其具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化活性，抗糖尿病作用和抗腫瘤作用[3，6-7]。然而，目前還尚不清楚PAE是否可以預(yù)防叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡以及與其發(fā)生相互作用的細胞內(nèi)因子。本研究擬探討PAE對TBHP損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制，為PAE防治心血管疾病提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于美國ATCC，并以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。PAE購于美國Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司，4 ℃儲存。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CCK8購于日本同仁公司。Transwell小室購于美國康寧公司。兔抗人Cleaved-caspase 3多克隆抗體以及AlexaFluor 555驢抗兔二抗均購于美國Abcam公司。熒光倒置生物顯微鏡購于美國萊卡公司；Bio-Rad 550酶標儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組：體外培養(yǎng)HUVECs分為對照組（Control組）、造模組（TBHP組）和PAE處理組（各濃度PAE+TBHP組）。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、處理：HUVECs使用含10% FBS的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞長至80%～90% 時，用PBS清洗2次，加入0.025%胰酶（含0.02% EDTA）消化。等細胞全部脫壁漂浮后，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基中和胰酶，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用完培重懸HUVECs，調(diào)整細胞濃度為1×104個/mL的細胞懸液待用。PAE溶于DMSO中，配成100 mg/mL母液保存于4 ℃冰箱。所有濃度的PAE均由母液稀釋于1640培養(yǎng)基中。

1.2.3 CCK8實驗檢測PAE毒性及抗氧化作用：取各組上述細胞懸液按100 μL/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37 ℃ 5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別用不同濃度的PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）處理不同組別的細胞，再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。用于毒性測試的細胞，向每孔加10 μL CCK8溶液；用于抗氧化檢測的細胞用TBHP刺激4 h后，向每孔加10 μL CCK8溶液，移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育1 h，取出培養(yǎng)板，用全自動酶標儀測定每孔的吸光度（OD）值，測定波長450 nm，并繪制細胞增殖曲線。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。

1.2.4 LDH釋放實驗檢測HUVECs活性：HUVECs在96孔板中以每孔1×104的密度培養(yǎng)，并使其生長至所需的密度。將細胞用PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預(yù)處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。將Control組的數(shù)值作為細胞活力的標準參數(shù)。使用LDH分析試劑盒分析釋放到培養(yǎng)基中的LDH以確定LDH活性。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。

1.2.5 Transwell遷移實驗：HUVECs在96孔板中以每孔1×104的密度培養(yǎng)，并使其生長至所需的密度。將細胞用PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預(yù)處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。隨后用100 μL無血清的1640培養(yǎng)基重懸各組HUVECs置于孔徑為8 μm的transwell小室上部。最后將1640 培養(yǎng)基（600 μL）和2%胎牛血清加入小室的下部。將細胞在37 ℃下培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，用濕棉簽擦拭每個transwell小室膜的上部以除去未遷移的細胞。遷移的細胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色（北京索萊寶公司）。從6個隨機選擇的顯微鏡視野計數(shù)平均遷移細胞數(shù)。

1.2.6 流式細胞實驗檢測細胞凋亡：將HUVECs（約1×105個細胞/孔）鋪板于6孔板中。然后用不同劑量的PAE處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。接著用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并以2 000 r/min離心10 min以重懸于binding buffer中。然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC，在黑暗中孵育15 min。在流式分析之前將5 μL碘化丙啶加入管中。使用BD FACSCalibur流式細胞儀（購于美國BD公司）進行流式細胞術(shù)分析，并通過Flowjo軟件進行分析。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。

1.2.7 免疫熒光檢測細胞凋亡：將Hela細胞接種到96孔板上。待細胞黏附到板上后，向細胞中加入不同濃度的PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預(yù)處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。將細胞用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton通透，5%山羊血清封閉，最后將Cleaved-caspase 3一抗（1:200，美國Cell Signaling Technology公司，#9664），加入到各個孔中，4 ℃冰箱過夜。第2天取出96孔板，吸出一抗，并用PBS清洗3遍，加入AlexaFluor 555二抗（1:300稀釋），37 ℃孵育1 h，加入DAPI染核5 min，應(yīng)用抗熒光淬滅劑封固。在熒光顯微鏡下觀察染色的細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗均重復(fù)3次。計量資料用表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響

PAE的化學(xué)分子式見圖1A。與Control組比，PAE+THBP組HUVECs的增殖能力較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HUVECs的增殖能力隨著PAE濃度的增加而增加，50和100 μmol/L PAE處理組的HUVECs增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且以50 μmol/L為最適濃度，見圖1B。

圖1 各個濃度的PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響

2.2 不同劑量PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs抗氧化應(yīng)激的影響 與Control組比，TBHP組細胞活力顯著降低，而LDH釋放升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與TBHP組比，PAE+TBHP組細胞活力顯著增加，LDH釋放顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；50和100 μmol/L PAE組的HUVECs細胞活力和LDH釋放差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），PAE發(fā)揮抗氧化應(yīng)激活性以50 μmol/L為最適宜濃度，所以下面實驗取25和50 μmol/L PAE，見圖2A和2B。

2.3 不同劑量PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs遷移能力的影響 與Control組比，TBHP組HUVECs遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與TBHP組比，各濃度PAE+TBHP組HUVECs的遷移能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；遷移細胞個數(shù)隨著PAE濃度的增加而增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A和3B。

圖2 PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs細胞活力和LDH釋放的影響

2.4 不同劑量PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響 不同劑量PAE預(yù)處理48 h后，TBHP誘導(dǎo)的凋亡細胞的數(shù)量以劑量依賴性方式減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4A和4B。與Control組比，TBHP組Cleaved-caspase 3的熒光強度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與TBHP組比，各劑量PAE+TBHP組Cleaved-caspase 3的表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A和5B。

圖3 PAE處理對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs遷移的影響

圖4 流式細胞學(xué)檢測PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

3 討論

血管內(nèi)皮是由一薄層上皮單核細胞組成，位于血管壁組織和血液之間，其復(fù)雜的系統(tǒng)具有多功能和分布廣泛的特點；血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)血液循環(huán)、抵抗炎癥侵襲以及維持血管內(nèi)外穩(wěn)態(tài)方面起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷是高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化的早期病理改變，隨著氧化應(yīng)激的進行，細胞內(nèi)氧自由基的堆積會促使細胞的凋亡[8]。因此，預(yù)防和拮抗內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷及其誘導(dǎo)的凋亡成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點和難點[9]。

細胞凋亡主要通過2種主要途徑，一種涉及死亡受體，另一種涉及細胞應(yīng)激途徑。這兩條途徑在caspase-3活化時會聚，因此caspase-3被認為是細胞凋亡發(fā)病機制中的關(guān)鍵酶。當(dāng)全長caspase-3（32 kDa）被激活時，它被切割形成兩個成熟亞基：p17（17 kDa）和p12（12 kDa）；因此Cleaved-caspase 3的水平代表活化的caspase-3的水平[10-11]。細胞凋亡會造成細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，會導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的LDH釋放到細胞外，所以檢測細胞外LDH的含量就可以反映細胞的存活狀態(tài)[12]。

圖5 免疫熒光檢測PAE對TBHP誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

PAE是一種從中藥中分離出來的活性化合物，其具有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，例如：抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化活性，抗糖尿病作用和抗腫瘤作用[3，6-7]。本研究選取正常細胞HUVECs為實驗材料，通過TBHP誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷細胞模型，通過CCK8及LDH釋放檢測旨在初步探討PAE是否具有拮抗由TBHP誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的功能。本研究結(jié)果表明，PAE具有促進HUVECs的增殖能力且與藥物劑量正相關(guān)，并能顯著增加細胞活力，PAE可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，保護內(nèi)皮細胞膜的完整性，從而減少從胞質(zhì)釋放入培養(yǎng)基的LDH。為了探索存活下的內(nèi)皮細胞功能是否完整，進一步進行transwell實驗，結(jié)果顯示在用PAE處理后，顯著改善了由TBHP氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮細胞功能的缺失，恢復(fù)了HUVECs的遷移能力。隨著細胞氧化應(yīng)激，細胞會募集并激活caspase-3，進而誘發(fā)Caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[8]。流式細胞和免疫熒光結(jié)果顯示，TBHP可誘導(dǎo)HUVECs的凋亡早期階段，而由PAE預(yù)處理的HUVECs通過抑制caspase-3蛋白的活化使其細胞凋亡水平明顯減弱。

本研究采用TBHP誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型考察PAE的抗氧化損傷作用。結(jié)果表明，PAE通過抑制TBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率降低、LDH釋放增加、細胞遷移減少，細胞凋亡增多、caspase-3蛋白的表達上調(diào)，從而發(fā)揮其對TBHP損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用。因缺乏體內(nèi)實驗的驗證，本研究的結(jié)果具有一定的局限性，但本研究為PAE的進一步開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。