李鈺瑩 崔孟超

摘?要?β?淀粉樣蛋白（β?Amyloid， Aβ）作為阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）的一個重要病理學特征，被認為是實現AD早期診斷的重要靶點。近年來，熒光成像技術，尤其是近紅外熒光成像技術（Near?infrared imaging）得到了快速發(fā)展。由于其靈敏度高，操作簡便，能夠避免生物組織自發(fā)熒光干擾，已成為體外生物樣本分析和小動物活體成像的重要手段。因此，靶向于腦內Aβ斑塊的近紅外熒光探針，對于AD的臨床前研究、組織病理學檢查、治療藥物的篩選和小動物模型的構建具有重要的意義。本文主要對基于分子內電荷轉移（Intramolecular charge transfer， ICT）機理的近紅外Aβ熒光探針進行歸納和總結，分析分子結構對于探針光學性質和生物學性質的影響，為開發(fā)新型高靈敏度的近紅外Aβ熒光探針提供了思路。

關鍵詞?阿爾茨海默病; Aβ斑塊; 近紅外熒光成像; 分子探針; 評述

1?引 言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）作為一種嚴重威脅老年人健康的神經退行性疾病受到了廣泛關注。然而，AD的致病機理仍不明確，發(fā)病過程緩慢且不易察覺，患者之間也存在較大的個體差異，使得目前臨床上很難在疾病可控期（即不可逆轉的腦損傷出現之前）對AD進行準確的診斷和有效的治療[1]。

目前關于AD的致病機理主要存在以下假說：β?淀粉樣蛋白級聯假說[2]; Tau蛋白異常磷酸化假說[3]; 膽堿能假說[4， 5]; 氧化應激假說[6]等。其中，β?淀粉樣蛋白級聯假說和Tau蛋白異常磷酸化假說得到了研究者的廣泛認可。這兩種假說都認為，在病理狀態(tài)下，大腦中的β?淀粉樣蛋白（β?Amyloid， Aβ）和Tau蛋白發(fā)生了錯誤的折疊，進一步促進了這兩種蛋白在腦內的不斷積累，逐漸影響腦內細胞（主要是神經元細胞）的正常生理功能，最終導致大腦的功能性損傷，直至死亡。這兩種蛋白作為與AD高度相關的生物標志物在2018年被納入了AD診斷的研究框架（A/T/N）[7]。該研究框架將AD認定為一個連續(xù)發(fā)展的過程，利用3種生物標記物的變化對AD進行疾病分期或區(qū)分AD及非AD型癡呆：“A”指聚集的Aβ或相關的病理學狀態(tài); “T”指聚集的Tau蛋白或相關的病理學狀態(tài); “N”是神經退行性變或神經元損傷。這3種生物標記物中，Aβ作為一種AD的特異性靶點，對實現AD的早期精確診斷至關重要。

1992年， Hardy和Higgins提出了Aβ級聯假說[2]，提出了AD的發(fā)病機理主要是腦內Aβ多肽片段產生與清除的失衡導致其在腦內不斷聚集最終產生不可逆轉的神經元損傷。正常情況下，大腦內由神經元細胞產生的淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein， APP）存在淀粉樣化水解和非淀粉樣化水解兩種途徑。非淀粉樣化水解主要是α分泌酶對APP進行剪切，形成sAPPα、 p3和α?C多肽片段，而淀粉樣化水解是APP經β分泌酶和γ分泌酶的連續(xù)剪切，最終形成Aβ多肽片段[8]。經過兩種水解途徑所產生的肽段主要通過酶降解或腦內小膠質細胞的免疫吞噬的方法被清除，也可以通過血液被轉運出血腦屏障（blood?brain barrier， BBB）。然而，當這種產生與清除的平衡被打破，腦內肽段數目激增，這其中具有神經毒性的Aβ肽段在細胞外不斷聚集沉淀，從單體變?yōu)楣丫垠w最終生成Aβ斑塊，致使突觸功能障礙和神經元細胞死亡（圖1A和1B）[9，10]。此外，Aβ斑塊又會刺激神經元分泌更多的Aβ肽段，并且促進Aβ肽段的聚集沉淀，這種級聯式的放大效果最終導致大腦發(fā)生不可逆轉的功能性損傷。

2017年，德國和荷蘭的科學家利用冷凍電鏡技術和固態(tài)核磁共振實驗對由兩條纖維原絲纏繞形成的Aβ1?42樣品進行了分辨率為0.4 nm的結構解析（圖1C～1F）[11]。多個Aβ蛋白分子有序的交錯排列形成了原纖維絲，兩條原纖維絲互相纏繞形成具有“LS”形拓撲結構的Aβ纖維，多個Aβ纖維聚集最終形成Aβ斑塊。其中，Aβ肽鏈的C?端被包裹在纖維結構的內部使其無法接觸外界的溶劑環(huán)境，而N?端則幫助形成β?折疊結構。

2?光學成像

光學成像作為分子影像的一個重要分支，具有非侵入性、損傷小、靈敏度高、價格低廉和成像快速等優(yōu)點，被廣泛用于細胞或分子水平的生物過程檢測。其中，近紅外熒光成像是應用最廣的一種熒光成像方式。

2.1?近紅外光學成像

通常情況下，光在穿透生物組織時其信號會被組織吸收或散射，造成信號大幅衰減，而且生物體內的自發(fā)熒光（波長通常小于600 nm）也會對信號的采集產生干擾。當探針的發(fā)射波長位于近紅外區(qū)域（Near?infrared， NIR， 650?900 nm）時，可以有效減少組織對光的散射和吸收作用，而且較低的激發(fā)能量對生物組織的損傷小。近紅外熒光成像技術已廣泛應用于分子生物學領域。

2.2?熒光探針的傳感機理

熒光探針的傳感機理主要包括：分子內電荷轉移（Intramolecular charge transfer， ICT）、聚集誘導發(fā)光（Aggregation?induced emission， AIE）、熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、光誘導電子轉移（Photo?induced electron transfer， PeT）和激發(fā)態(tài)分子內質子轉移（Excited?state intramolecular proton transfer， ESIPT）等。

研究表明，Aβ纖維內部形成的β?折疊空腔是一個疏水的非極性環(huán)境，而外部的生理環(huán)境則呈現出親水的極性狀態(tài)，當熒光探針與Aβ纖維結合進入疏水空腔后，探針周圍的微環(huán)境發(fā)生變化。其中，具有ICT效應的分子在激發(fā)狀態(tài)時，分子內部的電子云從電子給體（Electron donor， D）部分轉移至電子受體（Electron acceptor， A）部分，分子內部的偶極矩發(fā)生改變，使得其光學性質產生相應的變化。因此，具有ICT效應的分子探針對環(huán)境極性高度敏感，探針與Aβ蛋白結合后，在激發(fā)光的作用下，熒光發(fā)射波長和量子產率等光學性質發(fā)生明顯改變，達到熒光響應“開關”的效果，這對實現高靈敏度和高分辨率的成像非常有利。

2.3?基于ICT效應的熒光探針的設計思路

根據ICT效應的熒光發(fā)光機理，通常可通過增加共軛體系的電子傳輸能力、增強電子給體或電子受體的推拉電子能力來增強ICT效應，減小HOMO?LUMO之間的能隙差，推動熒光發(fā)射波長紅移進入近紅外區(qū)域。此外，平面剛性結構除了有利于電子的傳輸，對Aβ的親和力也有明顯的提高。值得注意的是，較大的π?共軛體系可能導致分子脂溶性較高，致使體內藥代動力學性質變差，不適用于活體成像。此外，作為神經中樞類的探針，能否穿過BBB是影響探針應用的首要條件，這主要是由分子大小和脂溶性協(xié)調作用的。

3?近紅外Aβ斑塊分子探針的研究進展

3.1?D?π?A類分子探針

2005年，Hintersteiner等[12]報道了第一個用于腦內Aβ斑塊近紅外熒光成像的分子探針AOI?987。該探針在小鼠血清中的最大熒光發(fā)射波長為670 nm，血清中熒光量子產率為0.41，滿足熒光成像的要求。盡管體外的飽和結合實驗表明AOI?987對Aβ聚集體具有中等水平的親和力（Kd=220 nmol/L），Stokes位移較?。?0 nm）且分子中帶有正電荷，但是活體熒光成像結果顯示，AOI?987能夠穿過BBB并有效區(qū)分AD轉基因小鼠和正常對照小鼠（圖2A）。另外，體內熒光染色結果也再次證實， AOI?987可以穿過BBB并與腦內的Aβ斑塊特異性結合。

同年，Nesterov等[13]報道了基于D?π?A結構的熒光探針NIAD?4用于腦內Aβ斑塊的雙光子顯微成像（Two?photon microscopy， TPM）。相比AOI?987，NIAD?4具有典型的推拉電子結構，而且選擇可旋轉的聯二噻吩作為π電子傳輸體系使得探針在不同極性的溶劑中表現出旋轉?共平面性。因此，當NIAD?4與Aβ聚集體內的疏水空腔結合后，分子內聯二噻吩的旋轉受阻，形成了一個更利于電子傳輸的共平面結構，熒光強度提高了400倍。這種共平面結構還有助于提高探針對Aβ蛋白的親和力（Ki=10 nmol/L）。TPM成像結果顯示，NIAD?4能夠清晰標記出腦實質中和血管壁上的Aβ斑塊（圖2B、2C）。然而，較短的發(fā)射波長（約為600 nm）并不利于活體熒光成像。為了改善光學性質，他們對電子給體進行了修飾，得到發(fā)射波長大于650 nm的近紅外熒光探針NIAD?11和NIAD?16[14]。

為了進一步提升探針的光學性質，同時改善生物學性質，提高活體成像的應用價值。自2014年起，研究者利用小分子探針與Aβ斑塊保持高親和力須具有剛性共軛結構的特點，在共軛雙鍵的兩端分別引入電子給體和電子受體，報道了一系列具有D?π?A結構的近紅外熒光探針，以整體分子識別Aβ斑塊（圖3）[15～17]。 這類探針結構簡單，合成與純化非常簡便，可以通過調節(jié)共軛雙鍵長度來調節(jié)發(fā)射波長，使其處于近紅外波長范圍內，同時滿足與Aβ斑塊的高親和力，與其它已報道的近紅外熒光分子探針相比具有明顯的優(yōu)勢。

2014年，Cui等[15]報道了D?π?A類的近紅外熒光探針DANIR 2c，與之前報道的探針相比，DANIR 2c具有最小的分子量和適宜的脂溶性，可有效穿過BBB，利于活體成像。該探針以苯環(huán)及反式多烯鍵作為π?橋連接了N，N'?二甲氨基（D）和二氰亞甲基（A），可通過調控多烯鍵長度來調節(jié)探針光學及生物性質。DANIR 2c具有典型的ICT效應，即探針在PBS溶液中熒光強度較弱，而與Aβ蛋白聚集體結合后進入疏水空腔內，周圍微環(huán)境極性的改變使探針的熒光強度增大。同時，這種剛性的平面結構對探針和Aβ蛋白的相互作用非常有利。體外競爭結合實驗表明，DANIR 2c對Aβ聚集體具有較高的親和力（Ki=36.9 nmol/L）。近紅外熒光成像結果顯示，DANIR 2c能夠快速穿透BBB，在轉基因小鼠腦內產生明顯的熒光信號滯留（圖4A和4B）。體內熒光染色的結果也進一步證實，腦內熒光信號的滯留主要是被DANIR 2c特異性標記出的Aβ斑塊所造成的。但DANIR 2c自身的熒光量子產率較低，需要進一步的修飾與優(yōu)化。

為了進一步提高探針和Aβ蛋白結合后的熒光發(fā)射波長，得到更優(yōu)的成像對比度和分辨率。2014年，Fu等[16]在DANIR 2c的結構基礎上，分別嘗試了丙二酸二甲酯、氰基乙酸甲酯、米氏酸和達米酮作為電子受體，設計合成了12個具有不同長度反式多烯鍵的近紅外Aβ熒光探針。實驗結果表明，相比DANIR 2c，部分探針的發(fā)射波長紅移進入近紅外區(qū)，并且具有明顯的ICT效應，然而探針的熒光量子產率仍然較低。有趣的是，親和力實驗結果顯示具有平面結構的電子受體（丙二酸甲酯和氰基乙酸甲酯）更有利于探針和Aβ蛋白的結合，分子對接模擬實驗也證實了這一點。其中，以氰基乙酸甲酯為電子受體的探針MCAAD?3的親和力最高（Ki=106 nmol/L），結合Aβ蛋白后熒光增強達到了26倍?；铙w熒光成像和體內熒光染色結果顯示，MCAAD?3可以穿透BBB并標記出腦內的Aβ斑塊，實現AD轉基因小鼠和正常對照小鼠的區(qū)分（圖4C和4D）。然而相比DANIR 2c，較低的親和力和熒光量子產率仍然限制了這類D?π?A探針的進一步應用。

基于以上研究，2015年，Zhou等[17]在DANIR 2c的基礎上引入了吸電子能力更強同時具有平面剛性結構的巴比妥酸衍生物作為電子受體，報道了BBTOs （巴比妥酸）、BBTSs （硫代巴比妥酸）和BBTOMs （二甲基巴比妥酸）3個系列的近紅外Aβ熒光探針。該系列探針的熒光發(fā)射波長和量子產率都得到了有效的提升，同時分子良好的平面性也大大提高了探針與Aβ蛋白的親和力，其中BBTOM?3的親和力最高（Ki=13.7 nmol/L）。然而，巴比妥酸的引入不僅增大了探針分子量，而且增加了形成潛在氫鍵的原子個數，導致探針的初始腦攝取值僅為0.83% ID/g，限制了在活體成像方面的應用（圖4E和4F）。

除了電子受體的改變可以影響分子探針的光學性質，減小HUMO?LUMO能量間隙也能影響分子的ICT效應，進而推動分子的熒光發(fā)射波長紅移。例如，共軛雙鍵長度的增加可以在一定程度上影響分子內部的極化程度，進而減小HUMO?LUMO的能隙，致使探針的發(fā)射波長紅移。2017年，Zhou等[18]又對苯環(huán)及反式多烯鍵的π?橋進行修飾，系統(tǒng)地探究了不同共軛雙鍵長度（n=2～6）以及不同芳環(huán)（苯、吡啶和嘧啶）對光學性質和生物學性質的影響。實驗結果表明，當芳環(huán)類型相同時，隨著共軛雙鍵的增長，紫外吸收波長和熒光最大發(fā)射波長的紅移呈現先增加后飽和的趨勢，而熒光量子產率和對Aβ蛋白的親和力以及初始腦攝取值則呈現出先增后減的趨勢; 當雙鍵數目相同時，芳環(huán)上N原子數目越多，其光學和生物學性質越差。最終篩選出具有苯環(huán)和4個共軛雙鍵的探針PHC?4，相比DANIR 2c熒光發(fā)射波長紅移了80 nm，活性提高了2.6倍?；铙w成像的結果表明，它能夠有效區(qū)分轉基因小鼠和正常對照組，體內熒光染色實驗也證實了這一點（圖5）。

上面介紹的探針都是以六元芳環(huán)和反式多烯鍵作為π?橋，其熒光量子產率普遍較低。為了進一步提高探針量子產率，得到更好的靶/非靶比圖像，Fu等 [19]在2015年設計了一系列以萘環(huán)為共軛體系的D?π?A類探針DANIR 3a?e。具有更大共軛平面萘環(huán)的引入使探針的光學性質得到了提升，也進一步增強了探針對Aβ聚集體的親和力。實驗結果表明，DANIR 3b在二氯甲烷溶液中熒光量子產率達到了30%，與Aβ蛋白結合后熒光強度增加710倍，相比DANIR 2c具有更好的熒光“開關（turn?on）”效果。體外熒光染色結果顯示，DANIR 3b可以快速且清晰的標記出人腦組織中的各種Aβ斑塊形態(tài)（血管斑，彌散斑和致密斑），而且飽和結合實驗測定的親和力常數（Kd=8.8 nmol/L）也遠高于DANIR 2c。此外，DANIR 3b還表現出了優(yōu)異的生物性質，其在正常小鼠腦部的2 min腦攝取值達到12.8% ID/g且腦內清除速率為

21.3倍（brain2 min/brain60 min）（圖6A）。然而，DANIR 3b和Aβ結合后熒光發(fā)射波長藍移至615 nm，不適于近紅外活體成像，但可作為高度靈敏的體外熒光染料應用。當共軛雙鍵數目增加至3個時，雖然發(fā)射波長紅移至近紅外區(qū)域且與Aβ聚集體有極高的親和力（Kd=1.9 nmol/L），但DANIR 3c的脂溶性較高，初始腦攝取值低，清除速率緩慢，也不利于活體熒光成像。

為了改善探針的藥代動力學性質，在不改變光學性質的前提下降低脂溶性，Fu等[20]進一步在電子給體的末端引入了不同數量的羥基，設計合成了化合物DANIR 8a?c和DANIR 9a?c。這些探針在保持對Aβ聚集體高親和力的同時，由于羥基的引入使得脂溶性降低，使其體內的生物學性質得到了有效改善。其中，DANIR 8c是目前報道的探針中最適合于活體近紅外熒光成像的Aβ探針，與Aβ聚集體結合后熒光發(fā)射波長為678 nm，熒光強度增強629倍，同時能快速穿過BBB （brain2 min=11.42% ID/g）。此外，由于DANIR 8c分子小，脂溶性適宜且與Aβ斑塊具有高親和力和選擇性，能夠在活體水平快速檢測Aβ斑塊，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)耗時的免疫熒光染色或選擇性較差、無法穿過BBB且發(fā)射波長較短的商品化染料（如剛果紅，硫磺素S等），目前DANIR 8c已經應用于體外組織切片Aβ斑塊對照染色和AD轉基因小鼠全腦Aβ斑塊三維標記，可與Aβ蛋白特異性抗體媲美[21，22]。值得注意的是，相比DANIR 8c，具有兩個羥基的DANIR 9c的初始腦攝取值很低（圖6B），不能滿足活體腦部成像的要求。因此，對于中樞神經系統(tǒng)熒光探針的開發(fā)，脂溶性和腦攝取值以及藥代動力學性質之間并不是簡單的線性關系，它們之間存在一個巧妙的平衡點。

在DANIR 8c的結構基礎上，Fu等[23]又將F原子引入到探針的給電子結構中，嘗試探究近紅外和切倫科夫雙模態(tài)成像在活體Aβ斑塊顯像中的應用前景。在活體近紅外成像實驗中，FDANIR 4c可以明顯區(qū)分轉基因小鼠和正常對照小鼠（圖6D和6E）。體外放射性自顯影的結果顯示[18F]FDANIR 4c可以特異性地標記出轉基因小鼠和AD病人腦切片上的Aβ斑塊。然而，由于18F核素的切倫科夫信號較弱且集中于藍綠光區(qū)域，嚴重影響了組織穿透能力和信號采集，因此，基于切倫科夫光的活體成像無法完全區(qū)分轉基因小鼠和對照組。

上述研究發(fā)現，靶向于Aβ的近紅外熒光探針為了優(yōu)化光學性質、提升親和力，都使探針形成了一個較大的剛性共軛結構。然而， 這種大的疏水共軛體系會造成探針脂溶性偏高，影響探針在活體內的性質。為了詳細探究分子脂溶性和剛性骨架結構對其光學和生物性質的影響，Zhou等[24]在DANIR 3b的基礎上對電子受體部分進行修飾，通過形成羧酸酯引入末端具有羥基和甲氧基的不同長度寡聚乙二醇鏈（Polyethylene glycol， PEG），制備了一系列新型的近紅外Aβ熒光探針。研究發(fā)現柔性PEG鏈的引入并不會對探針的光學性質和對Aβ蛋白的親和力造成太大的影響，卻實現了對探針脂溶性的快速調節(jié)，有效改善了分子的藥代動力學性質。其中，探針6d具有4個共軛雙鍵，含有2個PEG鏈且末端為羥基，其在正常小鼠腦內的藥代動力學性質 （brain2 min=11.42% ID/g，brain2 min/brain60 min=10.1）相比其它具有相同共軛雙鍵數目的萘環(huán)衍生物得到了顯著改善; 而光學性質和對Aβ聚集體的親和性仍主要由共軛體系部分決定。同時，活體熒光成像實驗再次證明探針6d可以有效區(qū)分轉基因小鼠和正常對照組，是一個理想的近紅外Aβ熒光探針（圖6C）。

除了Aβ蛋白，腦內由Tau蛋白構成的神經纖維纏結（Neurofibrillary tangles， NFTs）也是AD重要的生物標志物，在病理狀態(tài)下這兩種蛋白共享一個類似的β?折疊結構。目前已報道的ICT類分子探針，都是基于結合到β?折疊形成的疏水腔中使探針的微環(huán)境發(fā)生變化，進而產生熒光“開關”效果來實現蛋白檢測的，這也使得探針特異性不高， 提高探針對兩種蛋白的特異性和選擇性是設計的關鍵。大量研究表明，兩種蛋白β?折疊內部氨基酸殘基的排列及折疊方式并不完全相同，使得內部微環(huán)境存在一定的差異。因此，利用ICT類分子對周圍溶劑環(huán)境的高度敏感性，有可能實現針對不同蛋白有差異的熒光響應，從而利用多光譜成像技術實現同一探針對不同蛋白的分別檢測。2019年，Zhou等[25]采用對NFTs有一定熒光信號響應的喹喔啉環(huán)替換原本的萘環(huán)， 實現了對Aβ斑塊和NFTs的光譜分離檢測。喹喔啉環(huán)的引入不僅使探針可以高親和力的結合Aβ和Tau蛋白，同時也優(yōu)化了探針的光學性質、降低了分子的脂溶性。他們根據Ooshika?Lippert?Mataga方程計算發(fā)現，周圍環(huán)境介電常數（ε0）不同時， 探針具有不同的熒光響應波長。通過實驗數據對方程進行簡化，最終計算發(fā)現Aβ斑塊和NFTs內部的介電常數存在顯著差異，因此當探針與它們結合后產生的熒光響應波長不同，從而實現對它們的光譜分離檢測。并且對于Tau蛋白來說，肝素鈉誘導聚合的Tau蛋白（K18，大腸桿菌表達），AD轉基因小鼠腦內Tau蛋白和AD病人腦內Tau蛋白這3種來源內部的介電常數也不同，這也再次證實了Tau蛋白的復雜性， 且在體外難以實現模擬和重現。其中，探針17分別在人工聚合蛋白水平和組織切片水平上實現了對兩種靶點的光譜分離檢測（圖7A～7C）。此外，活體近紅外熒光成像表明探針17能夠穿過BBB并實現對AD轉基因小鼠和正常對照組的區(qū)分（圖7D和7E）。

3.2?D?π?A?π?D類分子探針

和D?π?A類分子探針相比，D?π?A?π?D形成的共平面結構更有利于電子的傳輸，光學性質更優(yōu)。此外，這種更大的剛性平面結構，對提高探針與β?折疊的親和力有顯著的作用（圖9）。

2009年，Ran等[26]報道了可作為近紅外熒光Aβ探針姜黃素類衍生物CRANAD?2。該探針利用姜黃素中的β?二酮結構與二氟化硼形成電子受體，通過苯乙烯π橋對稱連接N，N'?二甲氨基構成電子給體，形成D?π?A?π?D結構。CRANAD?2在PBS溶液中的發(fā)射波長達到了805 nm，而且具有較高的熒光量子產率和較大的Stokes位移。CRANAD?2對Aβ聚集體有明顯的熒光響應效果，和Aβ聚集體結合后熒光強度增加70倍，發(fā)射波長藍移至715 nm。體外和體內的生物評價均表明，CRANAD?2對Aβ斑塊有很高的親和力，且能夠穿過BBB特異性地標記出轉基因小鼠腦內的Aβ斑塊。隨后，該課題組對這類探針的電子給體部分進行了廣泛修飾，報道了一系列姜黃素類近紅外熒光Aβ探針[27～29]。其中，通過對探針與蛋白的結合模式進行模擬計算和實驗驗證，篩選得到的CRANAD?3[30]和CRANAD?58[31]不僅可以識別不溶性的Aβ聚集體，也對可溶性的Aβ寡聚體（包括單體）產生了明顯的熒光響應（圖8C～E）。定量的親和力測定結果表明，這兩個探針都對可溶性的Aβ蛋白具有較高的親和力（Kd<50 nmol/L），這對AD早期病理學研究和抗Aβ治療藥物的篩選有重要的指導意義。但是，該系列探針由于脂溶性較高導致藥代動力學性質不夠理想，腦內清除速率緩慢，在活體成像中難以獲得良好的靶與非靶比。此外，CRANAD?3和CRANAD?58還無法對不同形態(tài)的Aβ聚集體進行區(qū)分，仍需要進一步的修飾與優(yōu)化。

此外，Zhang等[31]還利用二價銅離子可以與Aβ肽鏈上兩個咪唑類的組氨酸位點配位， 誘導肽鏈之間纏繞聚集形成Aβ纖維這一理論基礎，在姜黃素類衍生物的電子給體上引入兩個咪唑環(huán)， 設計合成了CRANAD?17。借助姜黃素類衍生物對Aβ的良好靶向性，使探針可以通過與Cu2+配位，特異性的阻止其參與誘導Aβ蛋白聚集的過程。初步的體外生物評價證實，CRANAD?17可以快速“鎖定”Aβ纖維的位置，然后通過競爭的方式將與Cu2+配位的Aβ肽鏈釋放出來，進而有效的阻止Aβ聚集體的形成。

在CRANADs的結構基礎上，Zhu等[32]用吡喃腈作為電子受體，報道了系列具有D?π?A?π?D結構的熒光探針，但PAD?5和PAD?6對Aβ纖維的親和力較差（Kd>104 nmol/L），無法進行活體熒光成像。2017年，Yang等[33]將羥基引入到電子給體上，合成了探針YHY?2，從活體成像結果表明，YHY?2可以快速穿過BBB，相比正常對照小鼠，在轉基因小鼠腦中有一定時間的滯留。盡管探針的親和力得到了明顯提升（Kd=23.5 nmol/L），然而，發(fā)射波長（640 nm）未達到近紅外區(qū)，仍是限制活體成像的關鍵。

為了優(yōu)化分子的光學性質和對Aβ纖維的親和力，Li等[34]將氰基?2?丁烯作為電子受體設計合成了一系列具有對稱D?π?A?π?D類結構的近紅外熒光探針DADNIRs。該系列探針合成與純化十分簡單，可以快速實現反式共軛雙鍵的延長，有效推動探針發(fā)射波長的紅移。同時這種良好的剛性共平面結構保證了它們對Aβ良好的親和性。其中，DADNIR?2的光學和生物學性質最優(yōu)，與Aβ聚集體的親和力達到了1.04 nmol/L。體外熒光染色結果表明，探針可以清晰的標記出轉基因小鼠和AD人腦切片上的Aβ斑塊。此外，體內熒光染色結果表明DADNIR?2可以快速穿過BBB并特異性的標記出轉基因小鼠腦內的Aβ斑塊。值得注意的是，該系列探針利用D?π?A?π?D結構的優(yōu)勢可將分子的骨架長度快速調節(jié)在1.5～1.9 nm，實現了對NFTs的選擇性檢測（2.5倍）。

4?總結與展望

Aβ斑塊作為AD的特異性生物標記物，聯合A/T/N診斷研究框架，是實現臨床精確診斷的重點，同時也是AD治療藥物的一個主要靶點和藥效評價標準。因此，開發(fā)靶向于腦內Aβ斑塊的熒光分子探針并探究其結合模式具有重要的科學意義和應用價值。此外，大量的研究結果表明，處于疾病進程早期的Aβ寡聚體（Oligomer）具有更高的神經毒性，因此靶向于Aβ?oligomer的熒光探針的研發(fā)對AD的早期診斷和探究其病理學機制具有更重要的意義。

目前，靶向于Aβ的近紅外探針大部分都是基于ICT的發(fā)光機理，自身的發(fā)射光背景信號高，使得圖片的對比度不高。因此，開發(fā)基于其它發(fā)光機理的探針，例如PeT效應、AIE效應、FRET效應等，有可能避免探針自身熒光信號的干擾，獲得對比度和分辨率都更好的圖像。

生物組織穿透能力差和空間分辨率不足也是熒光成像面臨的重要問題，開發(fā)可用于多光子成像或具有更長發(fā)射波長的探針是克服這類問題的關鍵。多光子成像技術采用紅外或近紅外光作為激發(fā)光源，在避免紫外光對生物樣品損傷的同時提高了穿透深度，更有利于獲取深層次生物組織的圖像。此外，熒光信號采集效率高，得到的圖片對比度會明顯優(yōu)于單光子成像結果，并且可以實現準確定量分析。近年來，多光子成像技術，尤其是雙光子成像技術廣被泛應用于分子生物學研究中。然而，雙光子成像發(fā)射光波長較短，生物組織穿透能力較差，并不適用于活體動物模型。

具有更長發(fā)射波長的近紅外二區(qū)熒光探針的開發(fā)有助于克服生物組織穿透力弱這一問題。近紅外二區(qū)探針的發(fā)射波長普遍在1000～1700 nm，其穿透深度相比于近紅外一區(qū)探針提高了50倍，達到了3 mm。 此外，它的激發(fā)光也多在800 nm以上，對深層生物組織的成像具有無法比擬的優(yōu)勢。因此，近紅外二區(qū)的Aβ熒光探針的開發(fā)對小動物模型的無損傷深度檢測具有重要價值。

值得注意的是，研發(fā)探針，都需要綜合衡量光學性質和生物學性質，找到合適的平衡點。而對于靶向中樞神經類系統(tǒng)的熒光探針，除了考慮分子結構對親和力和藥代動力學性質的影響，還要特別注意分子大小、脂溶性等因素對于穿透BBB和細胞膜的影響。

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Progress of Near?Infrared Fluorescent Probes

for β?Amyloid Plaques in the Brain

LI Yu?Ying， CUI Meng?Chao*

（Key Laboratory of Radiopharmaceuticals， Ministry of Education， College of Chemistry，

Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

Abstract?β?Amyloid （Aβ） plaques as one of the important pathological hallmarks of Alzheimer's disease （AD） are regarded as key target for diagnosis of AD in early stage. In recent years， near?infrared fluorescence （NIRF） imaging has been developed rapidly， and has become a remarkable， noninvasive and inexpensive optical imaging tool for in vitro biological analysis， in vivo diagnosis and drug screening in animal models. In this review， we summarize current NIRF Aβ probes with sensing mechanism based on the intramolecular charge transfer （ICT） and outlined the influence of chemical structures on optical and biological properties， which is important for further development of high?sensitivity NIRF Aβ probes.

Keywords?Alzheimer's disease; β?Amyloid plaques; Near?infrared fluorescence imaging; Probes; Review