張芙莉　邱權發(fā)　楊小柯　黃衛(wèi)華

摘?要?神經系統(tǒng)是人體重要的指揮系統(tǒng)，神經細胞之間的信息交流主要依賴于突觸前分泌的神經遞質等順行性信號分子以及突觸后釋放的逆行性信號分子。一氧化氮（NO）是一種重要的逆行性信號分子，能夠調節(jié)突觸強度和突觸可塑性以適應不同的生理需求。然而， 目前鮮有逆行性信號分子釋放檢測的報道。為了實現突觸后釋放逆行性信號分子NO的實時監(jiān)測，本研究在碳纖維電極表面修飾鉑納米顆粒，構建了一種具有高時空分辨率、高靈敏度、響應快速的超微電化學傳感器。首先采用L?精氨酸和谷氨酸刺激海馬神經元，證明了海馬神經元合成NO以及細胞膜上N?甲基?D?天冬氨酸受體結合谷氨酸后釋放NO的能力。在此基礎上，利用高鉀溶液刺激突觸前神經元胞體模擬神經沖動，誘導突觸前釋放神經遞質谷氨酸，成功檢測到突觸后神經元產生的NO信號。本研究結果直接證實了突觸傳遞過程伴隨著逆行性信號分子釋放，建立的方法為研究神經系統(tǒng)反饋調節(jié)和突觸可塑性機制提供了有力的工具。

關鍵詞?海馬神經元; 突觸傳遞; 逆行性信號分子; 一氧化氮; 電化學檢測

1?引 言

神經系統(tǒng)是人體的最高指揮系統(tǒng)，調控機體的各項生理活動，神經細胞之間的信號轉導是神經系統(tǒng)發(fā)揮其功能的基礎。因此，研究神經信號轉導的分子機制，對于探索大腦的功能、理解神經退行性疾病的致病機理以及開發(fā)相應的療法具有重要意義。

在神經系統(tǒng)中，細胞之間的信息傳遞主要依靠突觸結構完成，突觸是一種神經元細胞膜高度異化的結構，包括突觸前結構、突觸間隙和突觸后結構三個部分[1，2]。當突觸受到外界影響或自身環(huán)境變化時，突觸的結構和傳遞性能也會隨之改變，這一現象被稱為突觸可塑性。突觸可塑性的實現依賴于突觸前與突觸后之間的信息交流，其中突觸前的正向信號傳遞主要由神經遞質等順行性信號分子完成，突觸后向突觸前傳遞信號則依賴于逆行性信號分子[3，4]。逆行性信號分子是指由突觸后細胞生成或者由突觸活動誘發(fā)，并作用于突觸前神經元，調節(jié)突觸強度、神經興奮性以及信號傳遞的分子。根據其自身性質，逆行性信號分子可以分為三類：膜結合型分子、外分泌因子和膜滲透性分子。其中， 膜滲透性分子以一氧化氮（NO）為主，可以通過擴散作用經過突觸后細胞膜和突觸間隙直接進入突觸前末梢。如在海馬神經元中，突觸前膜釋放的神經遞質谷氨酸與突觸后膜上的N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）受體結合[5]，引起Ca2+內流，在鈣調蛋白的作用下，一氧化氮合酶（NOS）被激活，催化底物L?精氨酸生成NO，生成的NO擴散至突觸前末梢，調節(jié)突觸強度[4，6]。在神經科學領域，科研人員主要利用轉基因、細胞藥理學、電生理等手段研究NO的反饋調節(jié)作用，并且取得了顯著進展，逐步揭示了NO的作用通路以及生理效應[7～9]。但是，目前還鮮有直接檢測突觸后逆行性信號分子NO釋放的報道。

用于直接檢測NO的方法很多[10]，如化學發(fā)光法[11]、熒光法[12]、電子順磁共振技術[13]、電化學方法[14～17]等。由于生物體內NO含量低，且極不穩(wěn)定，衰減速率快，所以要求檢測方法具有很高的時空分辨率和優(yōu)良的檢測性能。超微電化學方法具有檢測靈敏度高、時空分辨率高、儀器簡單的優(yōu)點[14，17～20]，非常適用于單細胞水平NO的實時動態(tài)監(jiān)測。

本研究構建了高靈敏的超微電化學傳感器，用于單個神經元以及突觸后NO釋放的實時監(jiān)測。首先利用L?精氨酸和谷氨酸刺激海馬神經元，證明體外培養(yǎng)的海馬神經元具備合成和釋放NO的能力。在此基礎上，使用高鉀溶液刺激突觸前神經元胞體模擬神經信號傳遞過程，成功檢測到突觸后神經元釋放的逆行性信號分子NO（圖1）， 為神經系統(tǒng)突觸可塑性中NO的生理功能研究提供了新方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

KQ3200DA超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; Synergy?UV超純水機（電阻率大于18 MΩ·cm， 法國默克密理愽）; CHI660A電化學工作站（上海辰華有限公司）; SW?CJ?1FD超凈工作臺（蘇凈集團安泰空氣技術有限公司）; GI54DWS高壓滅菌器（致微儀器公司）; Hera cell 150二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司）; Zeiss SIGMA掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司）; P?2000激光拉制儀（美國Sutter Instrument Company）; MF?200拋光儀顯微鏡（美國World Precision Instruments Inc）; 手動微操作手（手動三軸微操，江蘇瑞明生物科技有限公司）; LSP04?1A注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）; EPC?10膜片鉗電流放大器（德國HEKA公司）; TransferMan NK2電動微操作手（德國艾本德公司）; AxioObserver Z1倒置光學顯微鏡（德國蔡司公司）。

碳纖維（直徑5～7 μm， 英國Goodfellow Cambridge Limited公司）; 導電碳膠（利用石墨粉與奧斯邦環(huán)氧灌封膠150T?A組分手動調制而成，使用時加入少量150T?B混合即可固化）; AB膠（改性聚丙烯酸酯）; 1B100?4和1B100F?4玻璃毛細管（美國World Precision Instruments， InC）; 新生SD大鼠（湖北省實驗動物研究中心，具備實驗動物使用許可證）; 氯鉑酸（H2PtCl6·6H2O，上海試劑一廠）; 谷氨酸（Glutamate， Glu）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、胰蛋白酶、基礎培養(yǎng)基DMEM?F12和B?27、雙抗（青霉素+鏈霉素）（Amresco公司）; 神經生長因子（NGF）、聚賴氨酸（PLL）、層粘連蛋白（Laminin）、L?精氨酸（L?Arg）、L?NAME、Hemin（美國西格瑪公司）。其余試劑均購買于國藥集團; 所用試劑，如未特殊說明均為分析純，且未經進一步純化直接使用。

2.2?實驗方法

2.2.1?碳纖維微米電極的制備?利用導電碳膠將長度為1～2 cm的碳纖維與銅絲粘結，并依次將碳纖維浸入無水乙醇和超純水中超聲清洗，晾干。從拉制儀拉制的尖端口徑為5～7 μm的玻璃毛細管尾部穿入碳纖維?銅絲，并伸出毛細管尖端約50 μm，將玻璃管尖端靠近酒精燈火焰，熔融封口。再將裸露的碳纖維撞擊玻璃平面形成尖端碳纖維長度約5 μm的微柱電極。最后采用AB膠密封玻璃管和銅絲連接處。

2.2.2?微電極電化學性能的表征?采用循環(huán)伏安法（CV）進行電極表征，電化學實驗采用兩電極體系：微電極為工作電極， Ag/AgCl電極為參比電極和對電極，1 mmol/L鐵氰化鉀為電化學探針。循環(huán)伏安檢測均在CHI660A電化學工作站上進行。

2.2.3?微電極的修飾?利用電化學還原法在微電極表面修飾鉑納米顆粒，采用兩電極體系：微電極作為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極和對電極，鍍鉑溶液為1 mmol/L氯鉑酸，0.2 mmol/L硫酸鈉。電沉積電位范圍為0.1 V～0.6 V，沉積電量為0.1 μC。并采用循環(huán)伏安法和恒電位計時電流法，表征鉑納米顆粒修飾的碳纖維微米電極檢測NO的能力。

2.2.4?神經細胞的獲得與培養(yǎng)?實驗所用原代海馬神經元取自新生SD大鼠海馬組織。具體步驟如下：取出新生幼鼠腦部，找出月牙狀的海馬體，沿著海馬區(qū)邊緣將海馬組織取出。將上述取出的海馬組織轉移至裝有0.125%胰酶消化液的培養(yǎng)皿，放入37℃細胞培養(yǎng)箱消化。3 min后，加入無血清培養(yǎng)基終止消化，并用移液槍反復吹打制成細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液接種于預先用0.02% PLL和10 μg/mLlaminin孵育過的玻片上，然后在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中。

2.2.5?細胞實驗?將細胞培養(yǎng)基移除，洗凈，換為細胞外液。利用倒置顯微鏡明場成像觀察細胞，尋找海馬神經元之間的突觸連接。預先用激光拉制儀制備尖端約為10 μm的毛細加樣管，灌入相應的刺激溶液，連接注射泵用于刺激細胞。利用微操作手分別將微電極和加樣管移動至細胞附近。加樣管距離刺激細胞約50 μm，電極尖端靠近待測細胞，在顯微鏡40倍物鏡下可以觀察到電極與細胞膜接觸，并使細胞膜輕微變形。采用安培法監(jiān)測信號，電壓設置為700 mV，利用膜片鉗放大器對信號進行放大，并使用軟件“Pluse”進行數據采集（采集頻率設置為1 kHz）。為減小噪音，上述操作均在法拉第籠中進行，并且相關儀器都已接地。

3?結果與討論

3.1??碳纖維微米電極的制備與表征

參考本課題組之前發(fā)展的方法[20]， 采用火焰熔融玻璃毛細管密封碳纖維，制備了碳纖維微米電極（Carbon fiber microelectrodes， CFMEs），電極尖端直徑約為3～5 μm，長度控制在5 μm左右（圖2A）。 此電極具有優(yōu)良的電化學性能，充電電流?。▓D2B），且不同批次制備的電極具有良好的重現性和穩(wěn)定性（圖2C）。

3.2?碳纖維微米電極的修飾和表征

為了增強電極對NO的響應性能， 采用電化學還原的方法在CFMEs表面沉積鉑納米顆粒。掃描電鏡結果（圖3A）表明，沉積的鉑納米顆粒尺寸約為50～100 nm，且分布均勻，無明顯團聚現象。利用循環(huán)伏安法考察鉑納米顆粒修飾的碳纖維微米電極（Pt/CFME）對NO的電化學檢測性能。與CFME相比，Pt/CFME對NO的響應顯著增強，當電壓達到0.5 V時可以觀察到明顯的電化學氧化電流，并在0.65 V處達到峰值（圖3B）。上述結果表明， 鉑納米顆粒被成功修飾在碳纖維電極表面，且對NO有良好的電化學檢測能力。

為了考察Pt/CFMEs對NO的定量檢測能力， 測量了電極對不同濃度NO的安培響應。結果如圖3C所示，電極對不同濃度的NO響應迅速，信號穩(wěn)定，在9～180 μmol/L濃度范圍內對NO具有良好的線性響應（R2=0.9829），電極靈敏度為66 nA L/mmol，檢出限為0.37 μmol/L。

3.3?L?精氨酸刺激海馬神經元釋放NO

細胞內的NO主要由NOS催化氧化L?精氨酸合成。為了驗證實驗中培養(yǎng)的原代海馬神經元合成和釋放NO的能力， 使用L?精氨酸溶液刺激單個海馬神經元，并對其釋放的信號進行檢測。

如圖4A所示，向正常海馬神經元加入L?精氨酸刺激液后，迅速檢測到電流上升信號（如曲線a所示，從起始上升到達到峰值耗時僅數十毫秒）。這是由于較高濃度的L?精氨酸進入細胞，被胞內的NOS迅速氧化生成NO，脂溶性的NO穿過細胞膜，擴散到神經細胞外，被電極檢測。為了驗證實驗中的電流信號來自NO，加入NOS的抑制劑（L?NAME）作為對照實驗，結果顯示， 該條件下使用L?精氨酸刺激液無明顯的安培信號產生（曲線b）。由此， 可以確認實驗中培養(yǎng)的海馬神經元具備合成和分泌NO的功能，且釋放的NO能被Pt/CFME順利檢測。

3.4?谷氨酸刺激海馬神經元釋放NO

為了模擬突觸傳遞中突觸前細胞胞吐釋放谷氨酸調控突觸后細胞的過程，直接利用谷氨酸溶液刺激海馬神經元，考察海馬神經元細胞膜上的NMDA受體被谷氨酸激活后是否引起NO釋放。如圖4B所示，當海馬神經元受到谷氨酸刺激后，產生明顯的安培響應信號，維持數秒鐘后逐漸減弱（曲線a）。為了驗證這一信號的來源，進行了如下兩組對照實驗。首先，加入NOS抑制劑 L?NAME，使用谷氨酸刺激神經細胞時，無明顯安培信號產生（數據未給出）。此外， 在檢測體系中加入NO的清除劑血紅素（Hemin），谷氨酸刺激海馬神經元時也無明顯安培信號產生（曲線b）。上述結果表明， 實驗中采集到的安培信號來源于海馬神經元釋放的NO，即NMDA受體被谷氨酸激活后可促使NO的合成與釋放。

3.5?高鉀溶液刺激海馬神經元突觸釋放NO

為了考察突觸傳遞過程中是否會釋放逆行性信號分子NO， 使用高鉀溶液刺激突觸前海馬神經元胞體[20]（刺激毛細管在圖中未顯示），產生的神經沖動沿軸突傳遞（圖中紅色虛線箭頭），到達軸突終端后引發(fā)谷氨酸胞吐釋放（圖中藍色箭頭所指處），將Pt/CFME置于突觸后膜處（圖中黑色箭頭所指處），對突觸后細胞釋放的信號進行實時監(jiān)測（圖4C）。如圖4D所示，實驗中有明顯的安培信號出現，說明在真實的突觸傳遞過程中，突觸后細胞會合成和釋放NO。前文中提到，反饋信使NO的生成路徑涉及到谷氨酸胞吐釋放以及突觸后膜上的NMDA受體激活等過程，因此，采用鎘離子抑制突觸前谷氨酸釋放（曲線b）或采用NMDA 受體拮抗劑美金剛[21]（曲線c）孵育細胞，抑制突觸傳遞過程。結果表明， 兩種情況下均無信號產生，進一步表明神經元在進行突觸信息傳遞時伴隨著逆行性信號分子NO釋放過程。相比于谷氨酸直接刺激海馬神經元產生的信號，高鉀溶液刺激突觸前細胞引起突觸后細胞產生的NO信號明顯變小，且持續(xù)時間縮短?？赡茉蚴歉邼舛裙劝彼徇^度激活NMDA受體產生神經毒性[22]，從而釋放大量NO[5]，且目前已有研究表明NO參與谷氨酸介導的神經興奮性毒性，而在正常突觸傳遞過程中，逆行性信號分子則會維持在一個合理水平。

References

1?Scannevin R H， Huganir R L. Nat. Rev. Neurosci.， 2000， 1（2）： 133-141

2?Zhen M， Jin Y. Curr. Opin. Neurobiol.， ?2004， ?14（3）： 280-287

3?Tao H W， Poo M M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2001， ?98（20）： 11009-11015

4?Hardingham N， Dachtler J， Fox K. Front. Cell. Neurosci.， ?2013， ?7： 190

5?Sattler R， Xiong Z， Lu W Y， Hafner M， Macdonald J F， Tymianski M. Science， ?1999， ?284（5421）： 1845-1848

6?Huang E P. Curr. Biol.， ?1997， ?7（3）： R141-R143

7?Son H， Hawkins R D， Martin K， Kiebler M， Huang P L， Fishman M C， Kandel E R. Cell， ?1996， ?87（6）： 1015-1023

8?Arancio O， Kiebler M， Lee C J， Lev?Ram V， Tsien R Y， Kandel E R， Hawkins R D. Cell， ?1996， ?87（6）： 1025-1035

9?Zhang B B， Jin H， Bing Y H， Zhang X Y， Chu C P， Li Y Z， Qiu D L. ?Front. Cell. Neurosci.， ?2019， ?13： 283

10?Hetrick E M， H. S M. Annu. Rev. ?Anal. Chem.， ?2009， ?2： 409-433

11?WoldmanY Y， Eubank T D， Mock A J， Stevens N C， Varadharaj S， Turco J， Gavrilin M A， Branchini B R， Khramtsov V V. Biochem. Biophy. Res. Commun.， ?2015， ?465（2）： 232-238

12?Yu H B， Xiao Y， Jin L J. J. Am. Chem. Soc.， ?2012， ?134（42）： 17486-17489

13?Hogg N. Free Radical Bio. Med.， ?2010， ?49（2）： 122-129

14?Wang Y X， Noel J M， Velmurugan J， Nogala W， Mirkin M V， Lu C， Guille Collignon M， Lemaitre F， Amatore C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2012， ?109（29）： 11534-11539

15?Bedioui F， Griveau S. Electroanalysis， ?2013， ?25（3）： 587-600

16?Liu Y L， Wang X Y， Xu J Q， Xiao C， Liu Y H， Zhang X W， Liu J T， Huang W H. Chem. Sci.， ?2015， ?6（3）： 1853-1858

17?Hu K K， Li Y， Rotenberg S A， Amatore C， Mirkin M V. ?J. Am. Chem. Soc.， ?2019， ?141（11）： 4564-4568

18?Li Y T， Zhang S H， Wang L， Xiao R R， Liu W， Zhang X W， Zhou Z， Amatore C， Huang W H. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2014， ?53（46）： 12456-12460

19?Zhang X W， Qiu Q F， Jiang H， Zhang F L， Liu Y L， Amatore C， Huang W H. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2017， ?56（42）： 12997-13000

20?Qiu Q F， Zhang F L， Tang Y， Zhang X W， Jiang H， Liu Y L， Huang W H. ?Electroanalysis， ?2018， ?30（6）： 1054-1059

21?Rogawski M A， Wenk G L. CNS Drug Rev.， 2003， ?9（3）： 275-308

22?Nishizawa Y. Life Sci.， ?2001， ?69（4）： 369-381

Real?time Electrochemical Detection of

Retrograde Messengers in Synaptic Transmission

ZHANG Fu?Li， QIU Quan?Fa， YANG Xiao?Ke， HUANG Wei?Hua*

（College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China）

Abstract?Nervous system is a significant command system， and the communication between neurons depends on anterograde messengers such as neurotransmitters released from presynaptic neurons and retrograde messengers from postsynaptic cells. As an important kind of retrograde messengers， nitric oxide can regulate synaptic strength for different physiological needs. Whereas， most current researches focus on presynaptic exocytosis of neurotransmitters but ignore the detection of retrograde messengers. To monitor retrograde messenger nitric oxide released from postsynaptic neurons， we developed an electrochemical sensor with rapid response， high sensitivity and spatio?temporal resolution by modifying platinum nanoparticles on carbon fiber microelectrodes. The ability of hippocampal neurons to synthesize and secrete nitric oxide was firstly evidenced by successful detection of nitric oxide released from L?arginine??or glutamate?stimulated neurons. On this basis， the neuronal transmission was initiated by stimulating presynaptic neuron with high potassium solution， and the nitric oxide released from postsynaptic neurons was monitored in real time. The results demonstrated that synaptic transmission was accompanied with the release of retrograde messengers. This method

has promising potential in exploring synaptic feedback regulation and plasticity in nervous system.

Keywords?Hippocampal neurons; Synaptic transmission; Retrograde messengers; Nitric oxide; Electrochemical detection