周 書(shū)，許 勇，赫永金，許迪鋒，方 良，林祖慶

(杭州市大江東醫(yī)院 肝膽胃腸血管外科，浙江 杭州 311225)

肝細(xì)胞肝癌為世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第5位[1]。多種癌癥基因或抑癌基因的異常表達(dá)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中起著關(guān)鍵作用[2-3]。沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為新近發(fā)現(xiàn)的一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙?；竅4]。在多種成熟組織中表達(dá)，胚胎早期即生殖細(xì)胞中含量豐富[5-6]。近年來(lái)，SIRT1與腫瘤的關(guān)系成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，但在肝細(xì)胞肝癌中的作用的相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。有報(bào)道顯示[7-8]，惡性腫瘤化療耐藥上SIRT1表現(xiàn)出促進(jìn)、抑制兩種現(xiàn)象，我們推測(cè)SIRT1的過(guò)表達(dá)在肝細(xì)胞肝癌中的耐藥機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。基于此，本研究通過(guò)探討SIRT1在肝癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)情況，SIRT1過(guò)表達(dá)與耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-gp)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(Top-Ⅱα)的相關(guān)性，為臨床合理用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 40例新鮮肝癌組織及匹配的癌旁組織取自剛切除的手術(shù)標(biāo)本，手術(shù)后即刻投入液氮保存。分別取部分新鮮組織分離組織蛋白、制作免疫組化切片。

1.2 主要試劑與儀器 本研究中使用的主要試劑與儀器見(jiàn)表1。

表1 主要試劑與儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western-blot 以研磨法勻漿肝癌組織，加400 μL單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織，置于冰上操作。裂解30 min后，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4℃ 12 000 rpm/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管，-20℃保存。以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液，水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓80 V，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120 V繼續(xù)電泳，至溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部，終止電泳。以4℃，300 mA恒流，70 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h，洗滌后，滴加兔抗SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα溶液，4℃過(guò)夜孵育。第二天加入TBST洗滌去除多余一抗，與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光儀上顯影，拍照保存。

1.3.2 免疫組化 (1)固定、脫水、包埋。取組織放入4%多聚甲醛里面固定3～4 h，取適當(dāng)大小組織放入包埋盒中，進(jìn)行脫水。打開(kāi)包埋機(jī)，將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機(jī)器組織槽中，進(jìn)行包埋。(2)切片、制片。打開(kāi)切片機(jī)，固定蠟塊，用力均勻，右手搖動(dòng)切片，左手用毛筆接片，制片。(3)組織化學(xué)染色。60℃干烤2 h脫蠟，二甲苯、梯度酒精、PBS沖洗凈殘余石蠟。以檸檬酸鈉，微波抗原修復(fù)，溫度控制在96 ℃～98 ℃。然后將切片放入熱鍋中15 min，最后自然冷卻室溫。以免疫組化筆圈圍住組織，并將切片放入濕盒中，盒中加入少量蒸餾水，滴加3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min。甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封閉液，放入濕盒內(nèi)，室溫10 min。滴加一抗蓋住組織，濃度為1∶200，然后放入濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜。第二天，4度冰箱取出濕盒，室溫復(fù)溫30 min，PBS沖洗，甩干水分，滴加二抗，室溫孵育10 min。每張片子滴加50 μL鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗凈后，100 μL DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。染色合適即可終止染色，自來(lái)水沖洗。蘇木素復(fù)染，1～2 min，細(xì)胞核變藍(lán)色即可終止，0.5%氨水反藍(lán)，1%鹽酸酒精分化3 s，自來(lái)水沖洗3 min。梯度酒精脫水，涼干片子后滴加適量中性樹(shù)膠封片，蓋上蓋玻片，封片，顯微鏡下拍照保存。

免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性顯色為不均質(zhì)棕色顆粒，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性率≥25%為陽(yáng)性，陽(yáng)性染色率<25%為陰性。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白提取 肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Huh7均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。根據(jù)中科院上海細(xì)胞庫(kù)說(shuō)明分別選擇DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度為整瓶80%～90%時(shí)傳代。以Western blot檢測(cè)各細(xì)胞株中SIRT1相對(duì)表達(dá)量，選擇相對(duì)表達(dá)量最高的肝癌細(xì)胞株加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑，處理48 h后，以M-PER提取細(xì)胞總蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SAS9.3。計(jì)量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。連續(xù)變量的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα在肝癌中表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1在40例腫瘤組織中，35例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率87.50%。P-gp在40例腫瘤組織中，33例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率82.50%。Top-Ⅱα在40例腫瘤組織中，8例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率20.00%。腫瘤組織中SIRT1、P-gp陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖1。

Western blot結(jié)果顯示，肝癌組織、癌旁組織中SIRT1灰度值分別為1.25±0.24、0.18±0.05； P-gp灰度值分別為1.16±0.23、0.17±0.06；Top-Ⅱα灰度值分別為0.19±0.08、1.12±0.20。肝癌組織中SIRT1、P-gp相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，肝癌組織中Top-Ⅱα相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌與癌旁組織中SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα相對(duì)表達(dá)量

2.2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)的相關(guān)性分析 以Western blot檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，SIRT1與P-gp表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.915，P<0.05)，SIRT1與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)(r=-0.906，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 SIRT1在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)情況 在肝癌細(xì)胞系中，SMMC-7721中SIRT1相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他肝癌細(xì)胞系，其次為Bel7402，再次為MHCC97，再次為HepG2，最后為Huh7；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 SIRT1抑制后P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)情況 在SMMC-7721細(xì)胞中， 加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑Selisistat后，SIRT1、P-gp表達(dá)量顯著下降，Top-Ⅱα表達(dá)量顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)量的相關(guān)性

圖3 肝癌細(xì)胞系中SIRT1相對(duì)表達(dá)量

圖4 SMMC-7721細(xì)胞中給予Selisistat處理對(duì)P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)的影響

3 討論

SIRT1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著重要的作用[10-11]。有報(bào)道顯示[12-14]，SIRT1基因在胃癌、前列腺癌、原發(fā)性結(jié)腸癌、急性髓細(xì)胞性白血病中均呈高表達(dá)，對(duì)多種正常生理性過(guò)程有著調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、ATP生成、胰島素分泌、尿素循環(huán)等[15-16]。研究表明[17]，SIRT1可通過(guò)去乙?；揎椊M蛋白，去乙酰化P53、FOXO等非組蛋白及DNA損傷修復(fù)蛋白等，參與細(xì)胞衰老、腫瘤發(fā)生。也有報(bào)道顯示[18]，SIRT1在多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)中具有重要的作用，在化療耐藥的腫瘤細(xì)胞中SIRT1表達(dá)顯著升高。多重耐藥為惡性腫瘤化療中的難點(diǎn)之一，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，臨床上逆轉(zhuǎn)途徑小，效果不甚理想。目前的研究發(fā)現(xiàn)[19]，多重耐藥主要通過(guò)P-gp蛋白/多重耐藥-1基因介導(dǎo)的改變藥物在細(xì)胞內(nèi)聚集，引起細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、特殊藥物靶點(diǎn)缺失，如Top-Ⅱα表達(dá)缺失等。基于此，我們推測(cè)SIRT1在肝癌中的異常表達(dá)可能與多重耐藥密切相關(guān)。

在肝癌組織中，我們以Western blot及免疫組織化學(xué)的方法觀察SIRT1的表達(dá)量，結(jié)果顯示，SIRT1在40例腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα，為T(mén)op-Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率的3.38倍。在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中，5株細(xì)胞均有不同程度陽(yáng)性表達(dá)。故我們認(rèn)為，在人肝癌組織中SIRT1總體表達(dá)量較正常組織升高，提示SIRT1可能為一種促癌因子。進(jìn)一步觀察肝癌組織中耐藥相關(guān)蛋白P-gp、Top-Ⅱα的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，P-gp陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα，為T(mén)op-Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率的3.13倍。Western blot結(jié)果也證實(shí)，P-gp相對(duì)表達(dá)量高于Top-Ⅱα。P-gp為ATP依賴的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，有MDR1基因編碼，可將細(xì)胞毒性物質(zhì)、各種抗腫瘤藥物排出細(xì)胞[19]。Top-Ⅱα為ATP依賴性酶，存在于各種正常分裂的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞中，在染色體形成、分離、DNA復(fù)制等過(guò)程中有著重要的作用[20]。既往的研究表明[21]，腫瘤細(xì)胞內(nèi)P-gp含量越高，腫瘤對(duì)化療的敏感性越低，Top-Ⅱα含量越高對(duì)Top-Ⅱα抑制劑敏感性越高，Top-Ⅱα表達(dá)下降可導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療藥物的耐受。這與我們檢測(cè)腫瘤組織中P-gp、Top-Ⅱα的表達(dá)結(jié)論一致，說(shuō)明肝癌的耐藥機(jī)制可能與P-gp、Top-Ⅱα異常表達(dá)有關(guān)。SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，SIRT1與P-gp表達(dá)量呈正相關(guān)，SIRT1與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)。提示SIRT1可能參與了P-gp、Top-Ⅱα的異常表達(dá)，影響多重耐藥的發(fā)生。為驗(yàn)證相關(guān)性分析的結(jié)果，我們選擇在SIRT1表達(dá)量最高的SMMC-7721細(xì)胞中，給予98 nmol/L的SIRT1特異性抑制劑Selisistat處理，結(jié)果顯示，處理后SIRT1、P-gp表達(dá)量顯著下降，Top-Ⅱα表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明SIRT1可能通過(guò)促進(jìn)P-gp蛋白，降低Top-Ⅱα蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的多重耐藥[22]。

綜上所述，SIRT1在肝癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織，SIRT1高表達(dá)與耐藥相關(guān)蛋白P-gp呈正相關(guān)，與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)。SIRT1可能參與肝癌多藥耐藥發(fā)生，可能與調(diào)控P-gp、Top-Ⅱα蛋白有關(guān)。