廣東天益生物科技有限公司 廣東湛江 524300

紅曲在中國(guó)有上千年的歷史，其自古以來(lái)就具有食用和藥用價(jià)值?？煞譃榫魄?、色曲和功能性紅曲。酒曲及色曲紅曲紅的開(kāi)發(fā)利用在國(guó)內(nèi)已達(dá)到較高的水平，功能性紅曲是指紅曲菌在發(fā)酵過(guò)程中可合成具有生物活性的代謝產(chǎn)物，如Monacolin K(下稱(chēng)MK)、麥角固醇、輔酶Q10等一類(lèi)紅曲[1]。而功能性紅曲目前生產(chǎn)僅限于三角瓶的固態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵結(jié)束放瓶經(jīng)粉碎干燥后的產(chǎn)品中標(biāo)志性產(chǎn)物MK的開(kāi)環(huán)比例普遍不高于30%，甚至平均維持在25%左右。

鑒于固態(tài)發(fā)酵功能性紅曲的不足，目前眾多學(xué)者熱衷于研究液態(tài)發(fā)酵功能性紅曲。本公司致力于功能性紅曲發(fā)酵使用菌種的篩選，功能性紅曲的搖床水平發(fā)酵，功能性紅曲100L發(fā)酵罐液態(tài)深層發(fā)酵。其發(fā)酵液中標(biāo)志性產(chǎn)物MK的開(kāi)環(huán)比例平均達(dá)98%以上。在功能性紅曲發(fā)酵液的后處理工藝中，涉及到濃縮和干燥等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。功能紅曲的標(biāo)志性產(chǎn)物MK在高溫條件下，產(chǎn)品中的結(jié)合水被蒸發(fā)，然而開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)的MK失去水分子后便轉(zhuǎn)化為閉環(huán)結(jié)構(gòu)的MK[2]，發(fā)酵液中開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)的MK大大降低，使用價(jià)值便大大降低。所以十分有必要優(yōu)化功能紅曲發(fā)酵液的后處理工藝。

本文研究了以紫色紅曲菌NO.02為出發(fā)菌株的功能紅曲發(fā)酵液后處理工藝，確定了低溫減壓濃縮及低溫減壓干燥等工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

紫色紅曲菌(Monascus purpureus)NO.02菌株，廣東天益生物科技有限公司菌種室保藏。

1.2 試劑

MK標(biāo)準(zhǔn)品：酸型(開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu))和內(nèi)脂型(閉環(huán)結(jié)構(gòu))分別制備[2]。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

可溶性淀粉30g/L，麥芽糖30g/L，蛋白胨20g/L，瓊脂20g/L，pH值自然，約5.0～5.5。

1.3.2 搖床種子培養(yǎng)基

葡萄糖60g/L,蛋白胨25g/L,玉米漿10g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,k2HPO4·3H2O 1.5g/L，pH值自然。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

淀粉碳源80g/L，10%大豆水解液50g/L，玉米漿2g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O1g/L,k2HPO4·3H2O 1.5g/L，pH4.5。

1.3.4 培養(yǎng)方法

1.3.4.1 斜面菌種的培養(yǎng)

挑取1環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)斜面，約6d。

1.3.4.2 搖床種液的培養(yǎng)

用20mL無(wú)菌水洗滌試管斜面孢子，接種至裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃及120～200rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40～48hr。

1.3.4.3 100L發(fā)酵罐液態(tài)深層培養(yǎng)

搖床種子培養(yǎng)結(jié)束后，將搖床種液并瓶至抽濾瓶中，并將抽濾瓶密封，過(guò)種至100L發(fā)酵罐進(jìn)行功能紅曲液體深層培養(yǎng)。罐壓為0.03～0.05MPa；時(shí)間和溫度為0～24h、30～32℃,25～72h、27～30℃,73h～結(jié)束、24～27℃；攪拌轉(zhuǎn)速為80～120rpm；通風(fēng)量為2.5～5m3/h；培養(yǎng)時(shí)間為18～20d。

1.4 分析方法

1.4.1 水分測(cè)定

采用紅外線(xiàn)快速測(cè)定儀測(cè)定。

1.4.2 MK測(cè)定[3]

樣品的預(yù)處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取400.0～600.0mg試樣(濃縮液或粉狀菌絲體)于50mL容量瓶中。加入30mL75%乙醇(體積分?jǐn)?shù))，搖勻，室溫下超聲50min。加75%乙醇至接近刻度，再超聲10min，之后冷卻至室溫，用75%乙醇定容至50mL。以3 500r/min的旋轉(zhuǎn)速度離心10min。取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液待用。

HPLC檢測(cè)條件如下。

儀器：島津LC-20A。

色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm。

流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14(體積分?jǐn)?shù))。

流速：1.0mL/min。

柱溫：20～25℃。

進(jìn)樣量：20μL。

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器。

檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm。

1.4.3 錘度測(cè)定

采用錘度計(jì)測(cè)定。

1.4.4 pH值

采用精密pH計(jì)測(cè)定。

1.5 發(fā)酵液后處理工藝

發(fā)酵液過(guò)濾

1.5.1 固液分離

裁剪與布氏漏斗直徑相等的工業(yè)濾布，真空抽濾。

1.5.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

利用內(nèi)外氣壓差將濾液抽送至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，控制溫度45～80℃。

1.5.3 汽液分離

利用循環(huán)水泵將蒸汽抽至蛇形冷凝管冷卻后流到接收瓶，控制真空度為-0.065～-0.095MPa。

1.5.4 菌絲體粗粉碎

固液分離后的菌絲體成餅狀，利用粗粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，利于低溫減壓干燥，選取5～15目的篩網(wǎng)。

1.5.5 低溫減壓干燥

利用真空干燥箱對(duì)粗粉碎的菌絲體干燥，控制溫度45～90℃，真空度-0.075～-0.095MPa，控制水分小于8.0%[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固液分離

功能紅曲發(fā)酵液粘度、顆粒度、密度、代謝產(chǎn)物和過(guò)濾工藝條件等影響固液分離的效果[5]。而濾布的選擇在進(jìn)行固液分離的過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。濾布性能的好壞，選型的正確與否直接影響著過(guò)濾效果。本實(shí)驗(yàn)選取滌綸長(zhǎng)纖濾布、滌綸短纖濾布及錦綸301濾布對(duì)功能紅曲發(fā)酵液的固液分離效果進(jìn)行考察。所用發(fā)酵液體積3.0L，所選用的濾布均為300目，厚度1.13mm，大小裁剪成與布氏漏斗直徑(30cm)相等，進(jìn)行真空抽濾，結(jié)束時(shí)機(jī)是濾餅的水分為50%左右。

表1 不同濾布對(duì)發(fā)酵液過(guò)濾效果的影響

由表1結(jié)果可知，所選取的滌綸長(zhǎng)纖濾布的固液分離效果最好，發(fā)酵液的漏水性快速，壓榨到濾餅的水分為50%左右所需的時(shí)間最短，而且濾餅容易卸落，剝離性能好。

2.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及氣液分離

功能紅曲濾液中標(biāo)志性物質(zhì)開(kāi)環(huán)MK比例高達(dá)98%，但易受高溫影響，轉(zhuǎn)化為閉環(huán)的MK。而開(kāi)環(huán)的MK是我們所需，須從不同的溫度及不同的真空度探究最佳的濃縮效果，最大限度地維持濾液中有效價(jià)值。所用濾液的初始錘度為3.5BX，體積為5.0L,濃縮結(jié)束的時(shí)機(jī)為濃縮液錘度為38.0BX左右。

表2 不同溫度和真空度對(duì)濃縮液MK開(kāi)環(huán)比例的影響

由表2結(jié)果可知，隨著溫度的升高，濃縮時(shí)間越短。當(dāng)控制溫度90℃，真空度為-0.065MPa時(shí)，濃縮液沸騰過(guò)于劇烈，以至于跑料到冷凝水瓶。本實(shí)驗(yàn)不采用此溫度下得出的數(shù)據(jù)。當(dāng)溫度為80.6℃時(shí)，濃縮時(shí)間1.40h,開(kāi)環(huán)MK的比例大大降低。料液MK中的結(jié)合水被蒸發(fā)去除，轉(zhuǎn)化為閉環(huán)的MK。當(dāng)溫度為45.3℃，真空度為-0.095MPa時(shí)，汽液分離室中的濃縮液沒(méi)有沸騰，汽液分離速度一般，此時(shí)得到的濃縮液開(kāi)環(huán)MK比例最高。證明濃縮液中MK的結(jié)合水蒸發(fā)量少，轉(zhuǎn)化為閉環(huán)MK的比例低。當(dāng)溫度為70.1℃，真空度為-0.075MPa時(shí)，濃縮液沸騰，濃縮速率較快，同時(shí)得到產(chǎn)品開(kāi)環(huán)比例較高。在濃縮速率較快前提下，得到的產(chǎn)品開(kāi)環(huán)MK比例較高，符合產(chǎn)業(yè)化的要求。當(dāng)溫度為75.9℃時(shí)，真空度為-0.065MPa，濃縮液沸騰劇烈，雖然濃縮的速率很快，但得到產(chǎn)品開(kāi)環(huán)MK比例低。所以選擇最佳的濃縮溫度為70.1℃，真空度為-0.075MPa。

2.3 菌絲體粗粉碎

菌絲體濾餅干燥前須進(jìn)行粗粉碎，濾餅的細(xì)度越細(xì)干燥速度越快。粒度越細(xì)，越能增大粒狀濾餅與熱空氣的接觸面積，加快干燥速率。所用濾餅重量5.0kg，含水量50%，經(jīng)不同篩網(wǎng)的粗粉碎后，在相同溫度，相同真空度條件下，干燥至含水量6.30%左右，考察菌絲體的干燥效果。

由表3結(jié)果可知，粉碎的菌體濾餅經(jīng)干燥后會(huì)形成結(jié)團(tuán)的現(xiàn)象，結(jié)團(tuán)比例越大對(duì)后續(xù)的細(xì)粉碎工序的不良影響越大。

表3 不同目數(shù)篩網(wǎng)對(duì)干燥效果的影響

可能是菌絲體干燥前的顆粒較大，在真空干燥箱中，菌絲體的內(nèi)外受熱不均勻形成。當(dāng)菌絲體濾餅的粒度越細(xì)，結(jié)團(tuán)的比例越低，并且結(jié)團(tuán)的體積越小。同時(shí)，當(dāng)使用15目的篩網(wǎng)時(shí)，干燥的時(shí)間最少，結(jié)團(tuán)比例最低，結(jié)團(tuán)的體積最小。由于固液分離后的濾餅水分50%左右，選取20目以上的篩網(wǎng)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，大部分粗粉碎后菌絲體不能通過(guò)篩網(wǎng)，可能是由于其含水量高，粉碎的粒度達(dá)不到篩網(wǎng)的要求。所以選取15目篩網(wǎng)對(duì)菌絲體進(jìn)行粗粉碎。

2.4 低溫減壓干燥

固液分離后的菌絲體濾餅，經(jīng)粗粉碎后，開(kāi)環(huán)MK比例為98%左右，水分50%左右，需要對(duì)其進(jìn)行干燥，低溫常壓干燥，耗時(shí)長(zhǎng)，高溫常壓干燥，開(kāi)環(huán)MK轉(zhuǎn)化為閉環(huán)MK比例大。利用真空干燥箱對(duì)其進(jìn)行干燥。本實(shí)驗(yàn)考察不同溫度及不同真空度對(duì)菌絲體濾餅干燥效果。每批次所用的粗粉碎濾餅重量為5.0kg，干燥結(jié)束的時(shí)機(jī)為菌絲體水分小于8.0%。

表4 不同溫度和真空度對(duì)菌絲體干燥效果的影響

由表4結(jié)果可知，各批次菌絲體干燥結(jié)束后含水量在6.40%左右，相對(duì)平均偏差小，實(shí)驗(yàn)可比性高。表4中可以看出，溫度越高，干燥時(shí)間越短，同時(shí)所得產(chǎn)品MK開(kāi)環(huán)比例越低。再次證明產(chǎn)品中開(kāi)環(huán)MK在高溫下脫去結(jié)合水，轉(zhuǎn)化為閉環(huán)MK。當(dāng)溫度為72.2℃，真空度為-0.090MPa時(shí)，此時(shí)干燥時(shí)間較快，所得產(chǎn)品中開(kāi)環(huán)MK的比例較高。在干燥速率較高及產(chǎn)品開(kāi)環(huán)MK比例較高的情況下，此控制工藝較佳。當(dāng)溫度為43.9℃時(shí)，所得MK開(kāi)環(huán)比例最高，但耗時(shí)最長(zhǎng)，不適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。當(dāng)溫度為90.7℃時(shí)，干燥速率最快，但產(chǎn)品中MK開(kāi)環(huán)比例大大降低，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在此溫度下，產(chǎn)品有刺激的焦味?？赡芫z體翻動(dòng)的頻率低，接近不銹鋼托盤(pán)的菌絲體，在90℃高溫下被焦化。

3 結(jié)語(yǔ)

功能紅曲發(fā)酵液采用300目及厚度1.13mm滌綸長(zhǎng)纖濾布真空抽濾后，3.0L發(fā)酵液1.75h抽濾完畢，濾餅水分50%，過(guò)濾速率快，濾餅容易卸落。5.0L濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器及汽液分離器，控制溫度70.1℃，真空度-0.075MPa進(jìn)行減壓低溫濃縮，濃縮時(shí)間1.98h，所得濃縮液無(wú)焦味，功能紅曲應(yīng)有的氣味，色澤深棗紅，開(kāi)環(huán)比例85.66%，濃縮錘度為38.0BX。5.0kg濾餅經(jīng)15目篩網(wǎng)的粗粉碎機(jī)預(yù)粉碎，經(jīng)真空干燥箱,溫度72.2℃，真空度-0.090MPa，進(jìn)行低溫減壓干燥,干燥時(shí)間6.12h,所得產(chǎn)品無(wú)焦味，功能紅曲應(yīng)有的氣味，色澤棗紅，開(kāi)環(huán)比例69.28%，水分6.20%。該發(fā)酵液后處理工藝設(shè)計(jì)合理，符合食品藥品衛(wèi)生要求，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。