蘇州出檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心/蘇州華博檢測技術(shù)有限公司 江蘇蘇州 215100

青霉素是含有β-內(nèi)酰胺基母核結(jié)構(gòu)的一種抗生素,是獸醫(yī)臨床重要的抗生素之一[1]。青霉素類藥物的作用特點(diǎn)是通過抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性,阻止細(xì)胞壁的合成,從而起到殺菌作用[2]。在動物飼養(yǎng)過程中,該藥物主要用于治療動物的尿道、胃腸道、呼吸道和生殖及皮膚病毒感染的治療與預(yù)防,青霉素族藥物在動物源性食品中的殘留，會破壞人體腸道正常菌群環(huán)境,從而降低免疫力,給人的健康帶來危害[3]。

目前，用于動物源性食品中青霉素族檢測的方法，主要有微生物法及儀器測定法。微生物法是通過對特異微生物的生理機(jī)能、繁殖代謝的抑制作用實(shí)現(xiàn)對化合物的定性和定量，其缺點(diǎn)是專一性差，殘留量誤差也較大[4，5]。而以碳納米管為電極的電化學(xué)免疫法[6，7]，與酶聯(lián)免疫法[8]的測定結(jié)果也是。液相色譜法僅僅適用于基質(zhì)比較干凈的樣品，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品分析時(shí)，往往難于定量[9]。為此建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中的青霉素殘留量，由于該方法具有良好的適用性、定性分析和定量計(jì)算功能及具有較高靈敏度，成為測定畜產(chǎn)品中7種青霉素類藥物殘留量的主要方法[10～12]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470液質(zhì)聯(lián)用儀、氮吹儀(Organomation N-EVAP)、渦旋混合器(IKA)、電子天平(METTLERAE100)、高速離心機(jī)(湖南湘儀H2050R)、Milli-Q超純水器(Milli-Q,美國)；Atlantis dC18色譜柱(2.1×150mm,3m)色譜柱、Waters Oasis HLB固相萃取柱(6cc/500mg)。

阿莫西林(Amoxicillin純度98.70%)、氨芐西林(Ampicillin純度99.00%)、萘夫西林(Nafcillin純度99.9%)、苯唑西林(Oxacillin純度98.50%)、雙氯西林(Dicloxacillin純度97.27%)、氯唑西林(Cloxacillin純度98.96%)和青霉素V(PenicillinV純度98.6%)。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1.0mg/mL)：準(zhǔn)確稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)，用乙腈水(3+7)溶解后定容至10mL，置于-18C冰箱冷藏保存。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50mL離心管中，加入10mL乙腈，均質(zhì)30s，7 000r/min離心5min，取上清液至50mL離心管。再加入5mL乙腈再渦旋混合1min，離心，合并上清液，氮吹干，加入10mL 0.5%乙酸-50g/L鎢酸鈉的混合提取液，混勻器振蕩混勻1min。以1mL/min的速度通過預(yù)處理的OasisHLB固相萃取柱(用5mL甲醇，5mL水活化)中，用5mL含體積分?jǐn)?shù)5%甲醇淋洗，然后用5mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中，45C氮吹干，用2mL水溶解，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 高效液相色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

流動相:0.1mol/L。

甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈=90∶10(v/v)。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離源模式：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)。

電離源極性：正模式(ESI+)。

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

電噴霧電壓：3 500V。

鞘氣溫度：350℃。

鞘氣流速：11L/min。

干燥氣流速11L/min。

干燥氣溫度：300℃。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 7種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)

注：*定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理及檢測條件的選擇

2.1.1 流動相和色譜柱的選擇

根據(jù)已有的有關(guān)青霉素標(biāo)準(zhǔn)，采用了幾種不同流動相及不同的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先流動相分別選用了0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈、0.3mol/L乙酸水溶液+0.3%乙酸乙腈。采用0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈出峰時(shí)間穩(wěn)定，7種青霉素的相應(yīng)強(qiáng)度也很好；而采用0.3mol/L乙酸水溶液+0.3%乙酸乙腈出峰時(shí)間會偏移，且對個(gè)別青霉素的相應(yīng)強(qiáng)度比較低。因此選用0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈。色譜柱經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對比采用Atlantis dC18色譜柱(2.1150mm,3m)，出峰時(shí)間合理，以MS采集數(shù)據(jù)，見圖1。

圖1 7種青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Figure 1 Total ion -current chromatogram of 7 penicillin Standards

在選用固相萃取柱方面，主要考察了2種小柱分別是Oasis C18固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱。采用C18固相萃取柱時(shí)阿莫西林峰易干擾，總體回收率偏低，特別是對在低酸度和高酸度條件下會快速降解[13]。而選用Oasis HLB固相萃取柱時(shí)各種物質(zhì)出峰都比較好，回收率滿足試驗(yàn)要求。

2.2 線性響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

將7種青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按檢出限用水稀釋成相應(yīng)濃度，以定量離子色譜圖中各組分的峰面積定量。繪制物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，7種目標(biāo)化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 7種化合物的回歸方程

2.2.1 方法的回收率及精密度

向陰性的豬肉樣品基質(zhì)中分別添加檢出限的1倍、2倍、10倍3個(gè)濃度水平的7種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別平行測定6次，計(jì)算各種化合物的回收率的算術(shù)平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

2.3 質(zhì)譜圖分析

經(jīng)過一系列條件的優(yōu)化最終呈現(xiàn)7種青霉素的MRM峰型合理,相應(yīng)強(qiáng)度也高，需要特別關(guān)注的是青霉素V的出峰位置有一個(gè)干擾峰是氨芐西林，氨芐西林的出峰時(shí)間為7.0min而青霉素V的出風(fēng)時(shí)間在9.6min左右,其他6個(gè)目標(biāo)峰處均無雜質(zhì)峰干擾，分離度高，方法專屬性良好，具體MRM圖見圖2。

圖2 7種青霉素的MRM質(zhì)譜圖Figure 2 MRM Spectrograms of 7 Penicillins

3 結(jié)論

3.1 提取液和固相萃取柱的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中采用了3種提取液分別選用了：(1)0.15mol/L的磷酸二氫鈉緩沖鹽[14];(2)乙腈水(15+2)和0.05mol/L磷酸氫二鉀[15];(3)純乙腈和0.5%乙酸-50g/L鎢酸鈉的混合提取液。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用3.1(1)的提取液在過固相萃取柱時(shí)容易堵塞、信號相應(yīng)低、基質(zhì)效應(yīng)大、在氨芐西林出峰的位置會有一個(gè)干擾峰，因此該提取液不適用；采用3.1(2)提取液提取時(shí)先用乙腈水提取在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，過程中一方面液體容易產(chǎn)生泡沫噴出來，再用0.05mol/L磷酸氫二鉀溶解時(shí)回收率差只有20%～50%之間，樣品平行性差不能滿足實(shí)驗(yàn)要求；用3.1(3)提取液是乙腈能很好的提取樣品中青霉素物質(zhì)，在氮吹過程中也能克服起泡沫反噴的現(xiàn)象，用0.5%乙酸-50g/L鎢酸鈉溶解比較完全，回收率在65.10%～101.12%之間，樣品平行性好，因此最終選用乙腈和0.5%乙酸-50g/L鎢酸鈉的混合提取液作為提取液。

3.2 固相萃取柱的洗脫劑和溶解液

試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈水(1+1)、乙腈溶液作為固相萃取洗脫劑的效果。用甲醇時(shí)發(fā)現(xiàn)氯唑西林在甲醇中會快速降解，降解產(chǎn)物以酯類物質(zhì)為主對質(zhì)譜電噴霧離子化有影響[16]；采用乙腈水(1+1)時(shí)氮吹太慢，最終定容比較困難；用乙腈是不僅縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，對物質(zhì)也能很好地保留。溶解液選用純水和磷酸鹽緩沖溶液，發(fā)現(xiàn)用純水時(shí)物質(zhì)相應(yīng)比較高，基質(zhì)比較低，峰型好看；采用磷酸鹽緩沖溶液相應(yīng)低，雜質(zhì)峰多，峰型偏胖。

本試驗(yàn)采用了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了動物源性食品中7種青霉素的高效液相-質(zhì)譜檢測方法。該方法前處理簡便、線性良好、具有較高的平行性，可滿足國家標(biāo)準(zhǔn)檢測的要求，為相關(guān)部門風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供了方法學(xué)依據(jù)。