李丹 陳麗茹 劉玉潔

(衡水市第三人民醫(yī)院檢驗科，河北 衡水 053000)

肺結核的確診主要為痰抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養(yǎng)，但均存在明顯的局限。隨著纖維支氣管鏡的發(fā)展及普及，通過對氣管肺泡灌洗液進行相關檢測，肺結核的診斷率逐步提高[1]。本研究分析新型分子檢測方法利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增(Xpert MTB/RIF)檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法在肺結核灌洗液中的應用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年4月我院收治的疑診肺結核患者80例，其中男54例，女26例，年齡18～60歲，平均(43.29±8.77)歲。入選標準：(1)具有疑似肺結核的臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、咳嗽、咯血、胸悶等)；(2)纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗前3次痰涂片抗酸染色陰性或無痰；(3)胸部影像學改變(肺部陰影、感染或結節(jié))考慮活動性肺結核可能；(4)有纖支氣管鏡術及灌洗術適應證，取得氣管肺泡灌洗液，接受Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960及改良抗酸染色法檢測；(5)臨床各項資料完善；(6)患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：(1)合并肺外結核、復治肺結核；合并嚴重的其他感染性疾??；(2)伴發(fā)認知功能、交流障礙；(3)既往曾接受抗結核治療；(4)具有精神病、癲癇病史；(5)依從性差；(6)妊娠。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準通過。

1.2診斷方法 疑診肺結核患者以細菌學檢查陽性為確診結核病的依據(jù)，無細菌學陽性結果者則按《肺結核診斷標準》[2]進行診斷。

1.3檢測方法 患者均進行纖維支氣管鏡(奧林巴斯BF-P30)檢查，觀察各肺段支氣管黏膜病變情況，結合胸部影像學檢查結果明確病變累及肺段的支氣管，并進行刷檢、涂片，然后實施灌洗，相應支氣管肺段以纖支鏡灌入10～20 mL生理鹽水，并用纖維支氣管鏡負壓吸引回收灌洗液至無菌瓶內，可重復灌洗2～3次，最終確保收集灌洗液約10 mL，送醫(yī)院實驗室后平均分裝于①、②、③三管中，分別進行改良抗酸染色法、BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF技術法檢測。(1)改良抗酸染色法：將肺泡灌洗液標本以3000轉/min離心(離心半徑15 cm)20 min，詳細步驟參照中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會制定的實驗室檢查規(guī)程[3]進行操作，抗酸桿菌涂片染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。(2)BD BECTEC960法：以BD BECTEC960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)先后完成分枝桿菌的快速培養(yǎng)與藥敏鑒定，全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)及配套試劑購自美國BD公司。(3)Xpert MTB/RIF檢測：將1 mL肺泡灌洗液中加入1mL樣本處理液充分混勻，放置15 min并間斷搖晃至樣本完全液化，并以無菌吸管將2 mL液體移入試劑盒中，后者插入Gene Xpert檢測平臺中，輸入樣本相關信息后運行，Gene Xpert儀器自動完成樣本的過濾、洗滌，超聲溶菌釋放出DNA后與PCR反應試劑混合，以半巢式實時擴增并檢測熒光信號，儀器可于2 h后自動給出檢測結果，Gene Xpert儀器及試劑盒購自美國Cepheid公司。

1.4結果判讀 (1)改良抗酸染色法根據(jù)抗酸染色量的多少判定4+、3+、2+、1+和陰性。(2)BD BECTEC960法：結合BD BECTEC960系統(tǒng)報陽情況以涂片萋尼染色鏡檢排除雜菌的污染后進行液體藥物敏感性試驗，并統(tǒng)計儀器報陽時間。(3)Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的結果以循環(huán)次數(shù)(CT)確定結核分枝桿菌檢出情況，分為高(CT<16)、中(CT 16～22)、低(CT 23～28)、極低(CT 29～38)和未檢出(CT>38)5個量級；并明確利福平ropB基因的不同耐藥位點。

2 結 果

2.1三種方法檢測結核分枝桿菌的效能評價 58例患者明確診斷為肺結核，22例為非肺結核，包括慢性阻塞性肺疾病7例、普通肺炎6例、支氣管擴張4例、肺癌4例及播散性非結核分枝桿菌肺病1例。以臨床診斷結果為金標準，氣管肺泡灌洗液行BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值均高于改良抗酸染色法，BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的效能接近。見表1。

表1 三種方法檢測結核分枝桿菌的效能評價(n，%)

2.2Xpert MTB/RIF檢測半定量結果與改良抗酸染色法、BD BECTEC960法檢測結果的關系 Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測結核分枝桿菌結果分為高、中、低、極低和未檢出5個量級，15例高量級患者中，改良抗酸染色法檢測陽性率為100%，染色陽性級別3+～4+者占93.33%，隨著量級降低，陽性率、染色陽性級別3+～4+者所占百分比逐漸下降(χ2=13.95，18.32，P<0.05)；15例高量級患者中，液體培養(yǎng)法檢測陽性率為100%，報陽時間時間(17.22±2.56)d，隨著量級降低，陽性率逐漸下降(χ2=14.93，P<0.05)，報陽時間逐漸升高(F=19.07，P<0.05)。表2。

表2 Xpert MTB/RIF檢測半定量結果與改良抗酸染色法、BD BECTEC960法檢測結果的關系

2.3耐藥分析結果 同時獲取Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960法檢測結果均為陽性的52例患者藥物敏感性試驗結果，顯示二者對利福平的耐藥率分別為19.23%、21.15%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.06，P>0.05)；以液體藥物敏感性試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測菌株對利福平耐藥的敏感性、特異性分別為81.82%、97.56%。見表3。

表3 兩種檢測方法檢測菌株對利福平耐藥情況對比(n)

3 討 論

Xpert MTB/RIF技術是集樣品準備、標本處理、DNA提取、定量PCR擴增和熒光擴增檢測于一身的核酸擴增檢測分析系統(tǒng)，目前主要用于結核分枝桿菌特異核酸以及利福平耐藥基因rpoB突變檢測，在獨立的反應孔中加入待檢測樣品后2h內即可快速獲取檢測標本中是否含有結核菌及是否對利福平耐藥[4-5]。本研究結果顯示，肺泡灌洗液行BD BECTEC960法、Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的效能接近，且檢測結核分枝桿菌的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值均高于改良抗酸染色法，表明 Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法均可用于氣管肺泡灌洗液檢測以提高肺結核的診斷效能，與相關研究[6-8]結果一致。

本研究Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌結果分為高、中、低、極低和未檢出5個量級，15例高量級患者中，改良抗酸染色法檢測陽性率為100%，染色陽性級別3+～4+占93.33%，隨著量級降低，陽性率、染色陽性級別3+～4+所占百分比逐漸下降；15例高量級患者中，液體培養(yǎng)法檢測陽性率為100%，報陽時間時間(17.22±2.56) d，隨著量級降低，陽性率逐漸下降，報陽時間逐漸升高。提示Xpert MTB/RIF系統(tǒng)半定量量級程度可能與患者結核分枝桿菌菌數(shù)正相關，與陽性患者結核分枝桿菌培養(yǎng)時間負相關，這與N.Kwak[9]等的觀點類似，但本研究中的相關性仍有待進一步證實，但仍可以認為Xpert MTB/RIF檢測結果與BD BECTEC960及改良抗酸染色法檢測結果密切相關。此外，Xpert MTB/RIF檢測、BD BECTEC960法檢測細菌對利福平的耐藥率分別為19.23%、21.15%，差異不明顯，提示二者具有較好的一致性；且以液體藥物敏感性試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測菌株對利福平耐藥的敏感性、特異性均高于80%，進一步證實Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)可快速判定是否對利福平耐藥。與國內報道[10]一致。因此，Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)、BD BECTEC960及改良抗酸染色法中建議優(yōu)先選擇對肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF檢測。