陳 琳,唐志書,劉妍如,宋忠興,孔馨逸,魏思敏,孫 琛,鞠 浩

1陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育) 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西安 712046

白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F.var.formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，其性辛、溫，歸胃、大腸、肺經(jīng)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。臨床應(yīng)用廣泛，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿之功效，用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、帶下、瘡癰腫痛等癥[2]。

呋喃香豆素是白芷中的主要活性成分，《中國藥典》2015年版規(guī)定白芷干燥品中含歐前胡素的含量不得少于0.08%[2]。除歐前胡素外，白芷中還含有水合氧化前胡素、異歐前胡素、白當(dāng)歸素、氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯等呋喃香豆素成分[3,4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷及其活性成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤以及抗心腦血管疾病等多種藥理活性[5-9]。

四川、杭州、安徽、河南以及河北等地是白芷的主要產(chǎn)地，分別為川白芷、杭白芷、亳白芷、禹白芷和祁白芷，不同產(chǎn)地白芷的化學(xué)成分有較大差異[10]。除產(chǎn)地之外，加工方法是影響白芷藥材質(zhì)量的另一個重要因素，據(jù)報道，經(jīng)硫磺熏蒸后，呋喃香豆素類成分的含量顯著下降[11]，鎮(zhèn)痛活性也顯著降低，表明白芷活性成分易受產(chǎn)地、加工方式等的影響。目前對白芷質(zhì)量控制的研究，主要集中在歐前胡素、異歐前胡素等幾個呋喃香豆素成分的含量測定，也有白芷藥材HPLC指紋圖譜的研究[12,13]，但均未能較全面表征白芷藥材成分及影響各批次白芷藥材差異的標(biāo)志性成分。

指紋圖譜和化學(xué)識別模式是評價中藥質(zhì)量的重要方法，指紋圖譜可對中藥的已知和未知成分進(jìn)行全面綜合地表征，化學(xué)模式識別可以對指紋圖譜的信息進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)、識別和處理，兩者結(jié)合可以更加科學(xué)、客觀、系統(tǒng)地反映藥材的質(zhì)量信息，并越來越多的用于中藥材的質(zhì)量評價[14,15]。本研究擬采用高效、高靈敏度的UPLC方法，建立白芷不同產(chǎn)地和加工方式的UPLC指紋圖譜，采用對照品對各共有色譜峰進(jìn)行化學(xué)指認(rèn)，并結(jié)合聚類分析(cluster analysis，CA)、主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)以及正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等化學(xué)模式識別方法對所得指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，為白芷藥材全面的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)，配備Acquity UPLC PDA檢測器、Empower2工作站(美國Waters公司)；Legend Micro 17R微量離心機(美國Thermo公司)；CPA225D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；FA2004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；VORTEX-5渦旋儀(其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 藥品與試劑

花椒毒酚(批號：HX106886198)、異紫花前胡內(nèi)酯(批號：HM048527198)、水合氧化前胡素(批號：HA061413198)、白當(dāng)歸素(批號：HB157470198)、補骨脂素(批號：HP018120198)、花椒毒素(批號：HA061509198)、佛手柑內(nèi)酯(批號：HB204394198)、氧化前胡素(批號：HA062924198)、歐前胡素(批號：HI041232198)、異歐前胡素(批號：HI041233198)，以上對照品均購自寶雞辰光生物科技有限公司，純度>98%。甲醇(色譜純，美國Fisher公司)、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，其余為分析純；水為屈臣氏純凈水。本實驗搜集了四川、杭州、安徽、河南、河北等地的白芷藥材樣品，信息見表1，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心劉世軍副教授鑒定，為白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F.var.formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，其中S1、S3、S4、S7批次為硫磺熏蒸過的白芷樣品，S2、S5、S6、S8、S9、S10批次為無硫磺熏蒸過的白芷樣品。

表1 白芷藥材樣品信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

批次Batch編號Sample藥材Medicinalmaterial產(chǎn)地Origin加工方式ProcessingmethodS52018042205杭白芷浙江無硫熏S62018042206亳白芷安徽亳州無硫熏S72018042207亳白芷安徽亳州硫熏S82018042208禹白芷河南禹州無硫熏S92018042209祁白芷河北安國無硫熏S102018042210祁白芷河北安國無硫熏

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～5 min，10%～25% B；5～18 min，25%～60% B；18～22 min，60%～90% B；22～25 min，90%～10% B；25～30 min，10% B)；流速：0.2 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫25 ℃。在上述條件下，各色譜峰分離度良好，10批藥材的指紋圖譜和對照圖譜見圖1、圖2。

圖1 10批白芷藥材的UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of ten batches of A.dahurica 注：R 為對照指紋圖譜；S1～S10 分別為1～10批白芷藥材樣品。Note:R-the reference fingerprint;S1～S10 were A.dahurica samples.

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋制備成濃度為1 mg/mL的對照品儲備溶液；精密吸取上述各對照品儲備溶液適量，混合后加甲醇稀釋，配置混合對照品儲備液，其中含歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素500 μg/mL，水合氧化前胡素250 μg/mL，花椒毒酚、白當(dāng)歸素和佛手柑內(nèi)酯50 μg/mL，異紫花前胡內(nèi)酯、補骨脂素和花椒毒素25 μg/mL。

2.3 供試品溶液制備

取白芷樣品粉末(過3號篩)約1 g，精密稱定，置于50 mL的具塞錐形瓶，加入甲醇20 mL，稱重，超聲(功率300 W，頻率50 kHz)提取1.5 h，取出，放冷，用甲醇補足重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后進(jìn)入UPLC分析。

3 指紋圖譜研究結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗

按“2.3”項下方法制備1份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，由于歐前胡素在各批次白芷中均有出現(xiàn)，分離度良好且峰面積較大，故選擇歐前胡素(11號峰)作為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間和峰面積RSD均在3%以內(nèi)，表明儀器精密度良好。

圖2 白芷藥材的對照圖譜Fig.2 Reference fingerprints of A.dahurica

3.1.2 穩(wěn)定性試驗

按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24、48 h時進(jìn)樣分析，以歐前胡素作為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間和峰面積RSD均在3%以內(nèi)，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗

按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以歐前胡素作為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間和峰面積RSD均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜測定要求。

3.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批白芷藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下檢測，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版本)”軟件進(jìn)行處理，標(biāo)定22個共有峰，見圖1。10批白芷藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜比對，進(jìn)行相似度評價，其相似度依次為0.744、0.998、0.723、0.744、0.979、0.983、0.802、0.995、0.939、0.991，介于0.723～0.998之間。硫熏批次樣品(S1、S3、S4、S7)圖譜與對照圖譜的相似度范圍為0.723～0.802，小于 0.9；無硫熏批次樣品(S2、S5、S6、S8、S9、S10)與對照圖譜的相似度范圍為0.939～0.998， 均大于0.9，可見無硫熏藥材質(zhì)量與對照圖譜比較接近，質(zhì)量穩(wěn)定，優(yōu)于硫熏樣品。

3.3 主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn)

本研究采用對照品對各共有色譜峰進(jìn)行化學(xué)指認(rèn)，經(jīng)比對保留時間和紫外光譜兩項指標(biāo)，最終確認(rèn)了2、3、4、5、6、7、8、10、11、13等10個色譜峰，分別為花椒毒酚、異紫花前胡內(nèi)酯、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素等呋喃香豆素成分(見圖3)。

圖3 混合對照品(A)和白芷樣品(B)的UPLC色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms of mixed standard (A) and A.dahurica (B)注：2-花椒毒酚；3-異紫花前胡內(nèi)酯；4-水合氧化前胡素；5-白當(dāng)歸素；6-補骨脂素；7-花椒毒素；8-佛手柑內(nèi)酯；10-氧化前胡素；11-歐前胡素；13-異歐前胡素。Note:2-xanthotoxol;3- marmesin;4-oxypeucedaninhydrate;5-byak-angelicin;6-psoralen;7-xanthotoxin;8-bergapten;10-oxypeucedanin;11-imperatorin;13-isoimperatorin.

3.4 聚類分析(CA)

選擇白芷指紋圖譜中22個共有峰，將其峰面積相對于稱樣量量化，將10批樣品UPLC圖譜中22個共有峰的峰面積值標(biāo)準(zhǔn)化，組成10×22階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用SPSS 22.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，選用平均組間連接聚類，利用平均歐式距離法作為樣品間距離計算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖4所示，橫坐標(biāo)為樣品間的距離，縱坐標(biāo)為白芷藥材樣品編號(與表1相同)。由圖4可知，各批次白芷樣品主要分為兩大類，S1～S7聚為一大類(Ⅰ組)，其中S1、S3、S4、S7均為硫熏批次樣品，聚為一類；S2、S5、S6分別為四川、杭州、安徽無硫熏批次樣品，聚為一類；S8、S9、S10為河南、河北產(chǎn)地?zé)o硫熏批次樣品，聚為一大類(Ⅱ組)。

圖4 聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of hierarchical cluster analysis

3.5 主成分分析(PCA)

用SPSS 22.0軟件對量化的各共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對10批白芷藥材指紋圖譜所得的22個共有峰進(jìn)行主成分分析，求出相關(guān)矩陣的特征值及其方差，見表2。共提取出4個主成分，其中前3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到81.7%，可代表白芷指紋圖譜共有峰的大部分信息。

表2 主成分特征值及方差

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向，由圖5可見，22個變量對主成分1多成正相關(guān)，其中共有峰3、8～14、16、18、21對其貢獻(xiàn)最大；共有峰15、19、20對主成分2貢獻(xiàn)最大，共有峰4、5與其呈負(fù)相關(guān)；共有峰4、15、17對主成分3貢獻(xiàn)最大，共有峰7與其呈負(fù)相關(guān)。

進(jìn)一步通過將各特征向量中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后，10批樣品主成分得分如圖6所示，并以樣品的第 1、2、3主成分得分做三維散點圖，見圖7。如圖所示，S1、S3、S4、S7硫熏批次樣品聚為一類，S2、S5、S6批次樣品聚為一類，這與聚類分析結(jié)果完全一致；S8、S9批次樣品聚為一類，S10號無硫熏批次樣品，雖與S8、S9距離稍遠(yuǎn)，但均與第1主成分成正相關(guān)。

圖5 22個共有峰3個主成分的排序坐標(biāo)圖Fig.5 Coordinate diagram of three principal components in 22 common peaks

圖6 10批白芷藥材3個主成分的排序坐標(biāo)圖Fig.6 Coordinate diagram of three principal components in ten batches

圖7 主成分得分圖Fig.7 PCA score figure

3.6 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

為進(jìn)一步篩選出對不同批次白芷藥材質(zhì)量貢獻(xiàn)較大的成分，本研究采用Simca 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA分析。篩選變量重要性投影值(variable importance in project,VIP)>1.0的色譜峰，即該色譜峰對整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平。結(jié)果見圖8，橫坐標(biāo)為指紋圖對應(yīng)的色譜峰編號，縱坐標(biāo)為各色譜峰對應(yīng)的VIP值，根據(jù)VIP>1.0，共找到8個有意義變量，按照VIP值大小依次為 11號峰(歐前胡素)、8號峰(佛手柑內(nèi)酯)、9號峰、12號峰、10號峰(氧化前胡素)、13號峰(異歐前胡素)、16號峰、5號峰(白當(dāng)歸素)。表明上述色譜峰所對應(yīng)的化合物是白芷各批次藥材之間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志性成分，提示在白芷的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價中，應(yīng)重點關(guān)注這些成分的質(zhì)量變化。

圖8 10批次白芷藥材中各活性成分的VIP值Fig.8 VIP plot of active ingredients in ten batches of A.dahurica

3.7 組間差異性分析

為進(jìn)一步分析影響藥材質(zhì)量差異的主要成分，對22個共有峰進(jìn)行有無硫熏以及不同產(chǎn)地的組間差異性分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，22個共有峰中有8個峰的峰面積在硫熏批次樣品(S1、S3、S4、S7)和無硫熏批次樣品(S2、S5、S6、S8、S9、S10)間存在顯著差異(P<0.05)，無硫熏樣品中差異峰的峰面積顯著高于硫熏樣品；8個差異峰分別是5號峰、8～13號峰和16號峰，與OPLS-DA分析結(jié)果是一致的。

由于收集的相同產(chǎn)地批次樣品較少，根據(jù)聚類分析結(jié)果以及白芷產(chǎn)地的地理位置，分析北方產(chǎn)地(河南、河北)和南方產(chǎn)地(四川、浙江、安徽)無硫熏批次樣品間的差異性成分。組間差異性結(jié)果(表3)顯示： 4號峰、8～13號峰和14號峰的峰面積在北方和南方產(chǎn)地中均存在顯著差異(P<0.05)，除4號峰外，其他差異峰在北方產(chǎn)地的峰面積顯著高于南方產(chǎn)地。

表3 組間差異性分析

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 無硫熏批次樣品vs硫熏批次樣品；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 北方產(chǎn)地vs南方產(chǎn)地。

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 samples without sulfur fumigationvssamples with sulfur fumigation;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 the northern originvsthe southern region.

4 結(jié)論

本研究分別對提取溶劑(50%甲醇、75%甲醇、純甲醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇)、藥材-溶液比(1∶10、1∶20、1∶50、1∶100)以及超聲提取時間(0.5、0.75、1.0、1.5 h)進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以提取方法穩(wěn)定可行，提取效率最優(yōu)，色譜峰響應(yīng)、分離度良好為指標(biāo)，最終選擇的提取溶劑為純甲醇、藥材-溶液比為1∶20、超聲提取時間為1.5 h。

通過考察了樣品在甲醇-水、乙睛-水、甲醇-酸水和乙睛-酸水作為流動相系統(tǒng)時，各色譜峰的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙睛-水作為流動相系統(tǒng)時，各色譜峰的分離度最好，峰形最佳，基線較平穩(wěn)。用 PDA 檢測器對樣品進(jìn)行190～400 nm全波長掃描，比較各波長下色譜圖：除異紫花前胡內(nèi)酯在325 nm左右有較大吸收外，其他呋喃香豆素成分均在254 nm有較大吸收，且在254 nm處，色譜峰個數(shù)較多，分離度好，響應(yīng)合理，因此選定254 nm為白芷藥材指紋圖譜的測定波長。

白芷是一味重要的傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛，但對其質(zhì)量控制，尚缺乏系統(tǒng)的研究報道。本研究選取不同產(chǎn)地及處理方式的白芷藥材作為研究對象，建立了UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了22個共有峰，通過對照品對其中的10個成分進(jìn)行化學(xué)指認(rèn)。依次運用相似度分析、CA、PCA、OPLS-DA、組間差異性分析這5種方法對不同產(chǎn)地的白芷藥材 UPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，相似度分析、CA和PCA結(jié)果均說明，硫磺熏蒸是導(dǎo)致白芷藥材質(zhì)量差異的重要因素，沒有硫磺熏蒸的白芷藥材質(zhì)量明顯優(yōu)于硫磺熏蒸樣品。通過CA和PCA分析，硫熏批次樣品聚為一類，四川、杭州、安徽無硫熏批次樣品聚為一類，河南河北產(chǎn)地?zé)o硫熏批次樣品聚為一類，說明各產(chǎn)地白芷藥材質(zhì)量存在一定差異。進(jìn)一步采用OPLS-DA，篩選出影響不同批次白芷藥材質(zhì)量的主要成分，共找到8個主要差異性成分，經(jīng)對照品化學(xué)指認(rèn)出其中5個成分，分別為歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、異歐前胡素和白當(dāng)歸素，還需進(jìn)一步借助質(zhì)譜等方法對其他3個重要的差異質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行鑒定分析。最后對22個共有峰進(jìn)行了有無硫熏以及不同產(chǎn)地的組間差異性分析，有無硫熏兩種不同處理方式間有顯著差異的成分與OPLS-DA分析的主要成分相同，無硫熏樣品優(yōu)于硫熏樣品，這與硫熏影響白芷的鎮(zhèn)痛作用研究是相符的，為硫熏導(dǎo)致白芷的藥效作用降低提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；北方省份(河南、河北)和南方省份(四川、浙江、安徽)的白芷樣品間也存在較顯著差異，河南河北產(chǎn)地樣品優(yōu)于四川、浙江和安徽產(chǎn)地樣品。8～13號共有峰是影響白芷藥材質(zhì)量的中藥成分，雖未見不同產(chǎn)地白芷藥材藥效作用差異的研究報道，但根據(jù)我們前期的藥代動力學(xué)研究結(jié)果[1,3]，8號峰(佛手柑內(nèi)酯)、10號峰(氧化前胡素)、11號峰(歐前胡素)、13號峰(異歐前胡素)等均是白芷藥材的主要入血成分，且這些成分也是影響白芷藥效的主要成分，其含量高低直接影響臨床療效。上述實驗說明，硫熏和地理位置是影響白芷藥材質(zhì)量的兩個重要因素，可通過主要差異性成分對不同處理方式和產(chǎn)地的白芷藥材質(zhì)量進(jìn)行分析。

本研究首次采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)，較為系統(tǒng)、整體和全面的對不同批次白芷藥材質(zhì)量進(jìn)行了深入探索，對不同產(chǎn)地和處理方法的白芷藥材進(jìn)行分類，并篩選出了影響白芷藥材質(zhì)量的差異質(zhì)量標(biāo)志物，為白芷活性成分的鑒定、分析、質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究等提供了準(zhǔn)確、豐富的信息，補充了現(xiàn)有質(zhì)量評價方法的不足，同時為中藥全面質(zhì)量評價研究提供借鑒與思路。