黃舒婷，黃燕俊，梁穎欣，賴志明，文升祥，曾常青*

1廣東藥科大學中藥學院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣州 510006；2中山市中智藥業(yè)集團有限公司，中山 528437；3廣東南領(lǐng)藥業(yè)有限公司，梅州514600；4貴州省劍河縣科技局鉤藤研究所，劍河 556400

鉤藤為常用中藥，茜草科植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil是目前鉤藤藥材市場的主要品種[1]。鉤藤化學成分有生物堿類、黃酮類、三萜類、香豆素類及有機酸類等，其中生物堿化學成分已經(jīng)被廣泛的研究，但非生物堿成分研究較少。鉤藤葉與其藥用部位帶鉤莖枝化學成分相似[2]，Li等[3]提取分離了鉤藤葉3個生物堿和14個非生物堿，并分別進行了抗氧化活性測定。Luo等[4]對黔產(chǎn)鉤藤不同部位中總黃酮進行含量測定，發(fā)現(xiàn)總黃酮的含量是皮>葉>鉤>莖>木質(zhì)部>薄壁組織。Huang等[5]利用HPLC法測定鉤藤植物各個不同部位鉤藤堿含量。在民間一直有鉤藤葉藥用習俗[6]。課題組前期對鉤藤植物各部位進行成分和藥效活性研究發(fā)現(xiàn)：與帶鉤莖枝藥用部位相比，葉子中非生物堿成分含量高，并具有明顯的抗氧化活性。目前每年鉤藤藥材采收時，大量的葉子隨帶鉤莖枝的采摘而被當作廢物處理，造成大量的資源浪費。綜合開發(fā)利用鉤藤葉可以降低藥用部位的成本，擴大鉤藤的藥用部位，有益于資源可持續(xù)發(fā)展。鉤藤葉質(zhì)量控制方法研究較少，本文在鉤藤葉抗氧化活性追蹤等實驗基礎(chǔ)上，建立鉤藤葉的五種成分的含量測定方法，彌補了目前鉤藤葉質(zhì)量控制方法的不足，為鉤藤葉的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀(2996二極管陣列檢測器，Waters公司)，CNW C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海安譜實驗科技有限公司)，UV-1800紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)，KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率為120 W)。

1.2 試藥

對照品喜果苷(批號：MUST-16072110)、表兒茶素(批號：MUST-17060114)、綠原酸(批號：MUST-16072110)、蘆丁(批號：MUST-16122011)、金絲桃苷(批號：MUST-16102605)純度均>98%，均購于成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈、磷酸為色譜純，超純水，甲醇、沒食子酸(含量>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，其它試劑均為分析純。

1.3 樣品

鉤藤葉在廣東、貴州和廣西等鉤藤產(chǎn)地采集，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院曾常青教授鑒定均為茜草科植物鉤藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil)的葉子，樣品S1～S5，分別采集于貴州省劍河縣擺偉村、南明區(qū)、敏洞鄉(xiāng)、柳川鎮(zhèn)、岑松鎮(zhèn)；S6采集于貴州省凱里市；S7采集于貴州省興義市；樣品S1～S7，采集于2014年10月。S8采集于廣西省三江縣；S9采集于廣東省韶關(guān)市始興縣；S10～S12，分別采集于廣東省平遠縣畬腦村、大拓鎮(zhèn)、黃花陂村；樣品S8～S12，采集于2016年10月。將鉤藤葉樣品置于60 ℃烘箱中烘干，打粉，過40目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備

取綠原酸對照品約20 mg，表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷對照品約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL的容量瓶中，加70%甲醇使其溶解、定容至刻度，搖勻，即得各對照品母液，備用；其中對照品母液濃度為：綠原酸2.041 mg/mL，表兒茶素1.064 mg/mL，蘆丁1.005 mg/mL，金絲桃苷0.986 0 mg/mL，喜果苷1.060 mg/mL。精密量取適量的各對照品母液，置于50 mL的容量瓶中，再加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，其中綠原酸濃度為0.367 4 mg/mL、表兒茶素濃度為0.085 12 mg/mL、蘆丁濃度為0.020 10 mg/mL、金絲桃苷濃度為0.078 88 mg/mL、喜果苷濃度為0.021 20 mg/mL。置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備

2.1.2.1 抗氧化活性追蹤的各部位溶液制備

取貴州劍河縣鉤藤葉(S4)細粉15 g于500 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇300 mL，浸泡45 min，超聲45 min，濾過。濾液用石油醚萃取，棄去石油醚層，水層濃縮。濃縮液分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到各部位的萃取液，減壓濃縮各部位萃取液，最后于60 ℃減壓干燥至恒重。取各個部位固體25 mg，分別配制濃度為0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等部位供試品溶液。

2.1.2.2 五成分含量測定供試品溶液制備

取鉤藤葉約0.2 g，精密稱定，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱重；浸泡30 min，超聲30 min，冷卻，補重，搖勻，過0.22 μm的有機微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 鉤藤葉抗氧化活性部位追蹤

2.2.1 鉤藤葉總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法[7]，測定鉤藤葉中總酚的含量。以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.152X+0.008 9，r=0.999 3，沒食子酸在0～5.00 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。分別精密取0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三個萃取部位的供試品溶液0.5 mL至10 mL的容量瓶，按標準曲線制備方法測定鉤藤葉三個萃取部位的總酚含量，結(jié)果見表1。

2.2.2 鉤藤葉中總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉[8]，測定鉤藤葉中總黃酮含量。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.036 6X+0.05，r=0.998 8，蘆丁在0～20.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。分別精密取0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三個萃取部位的供試品溶液1 mL至10 mL的容量瓶，按標準曲線制備方法測定鉤藤葉三個萃取部位的總黃酮含量，結(jié)果見表1。

2.2.3 DPPH自由基清除能力測定

參考郭雪峰等[9]DPPH自由基清除能力測定方法。分別精密量取適量0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三個萃取部位的供試品溶液，置于50 mL的容量瓶中，再加甲醇定容至刻度，搖勻，即得三個萃取部位的不同濃度梯度的供試品溶液，其中乙酸乙酯部位濃度梯度為5.00～25.0 μg/mL；正丁醇部位濃度梯度為10.0～60.0 μg/mL；氯仿部位濃度梯度為10.0～200 μg/mL。依次加入不同濃度的三個部位供試品溶液1 mL、0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液3 mL于各試管中，充分混勻，避光靜置30 min后，于519 nm波長處測定其吸光度A0，另同法操作做空白對照，測定其吸光度A1。DPPH自由基清除率的計算公式：Y(%)=(A1-A0)/A1×100%。

清除DPPH自由基能力使用AE表示，AE=1/IC50，AE越大，其清除DPPH自由基的能力越大。結(jié)果見表1。

表1 鉤藤葉總酚、總黃酮含量和AE值

2.2.4 鉤藤葉抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)分析

采用SPSS21.0數(shù)據(jù)處理。結(jié)果表明鉤藤葉總酚含量與清除DPPH自由基的能力呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)為0.999。鉤藤葉總黃酮含量與清除DPPH自由基的能力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)為1.000。由表1結(jié)果及相關(guān)分析結(jié)果可知，鉤藤葉清除DPPH自由基的物質(zhì)基礎(chǔ)與酚類和黃酮類成分顯著正相關(guān)。對三個部位的HPLC色譜圖進行分析，根據(jù)對照品對照及各色譜峰光譜圖分析可知乙酸乙酯部位以綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷等黃酮和多酚類成分為主；正丁醇層以綠原酸、蘆丁等極性較大的黃酮苷和生物堿苷等為主；氯仿層以生物堿成分為主。結(jié)合課題組藥效成分的研究，本文建立鉤藤葉中綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷等活性成分的HPLC測定方法。

2.3 測定鉤藤葉5種成分的HPLC方法研究

2.3.1 檢測條件的選擇

2.3.1.1 檢測波長的選擇

分析5種成分的對照品溶液的HPLC色譜峰的光譜圖，比較各波長下5種成分色譜峰靈敏度和分離情況，選擇354 nm為定量檢測綠原酸、蘆丁和金絲桃苷的最佳波長，選擇226 nm為定量檢測表兒茶素和喜果苷的最佳波長(見圖1、圖2)。

圖1 樣品與混合對照品的高效液相色譜圖(354 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of sample and mixed standards (354 nm)注：1.綠原酸；3.蘆?。?.金絲桃苷。Note:1.Chlorogenic acid;3.Rutin;4.Hyperoside.

2.3.1.2 色譜條件

采用CNW C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為乙腈；流動相B為0.1%磷酸，梯度洗脫(0 ～ 25 min，8% ～ 13% A；25 ～ 27 min，13% ～ 15% A；27 ～ 55 min，15% ～ 16% A；55 ～ 60 min，16% ～ 22% A；60 ～ 75 min，22% ～ 30% A；75 ～ 80 min，30% ～ 35% A；80 ～ 90 min，35% ～ 35% A)，檢測波長為226、354 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃。

圖2 樣品與混合對照品的高效液相色譜圖(226 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of sample and mixed standards (226 nm)注：2.表兒茶素；5.喜果苷。Note:2.Epicatechin;5.Vincoside lactam.

2.3.2 鉤藤葉前處理

2.3.2.1 提取溶劑的考察

取鉤藤葉(S8)粉末4份，每份約1 g，精密稱定。分別精密加入30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇溶液各100 mL，稱重，浸泡30 min，超聲45 min，冷卻，補足重量，搖勻，過濾膜，按“2.3.1.2”項下色譜條件進行分析，四種提取溶劑制備樣品的五成分測定的峰面積結(jié)果見圖3。綜合4種溶劑對各成分的提取情況，選擇70%甲醇為最佳提取溶劑。

圖3 不同溶劑提取的鉤藤葉中5種成分的峰面積Fig.3 Peak area of five components in U.rhynchophylla leaves extracted at different solvents

2.3.2.2 提取時間的考察

取鉤藤葉(S8)粉末4份，每份約1 g，精密稱定。精密加入70%甲醇溶液100 mL，稱重，浸泡30 min，分別超聲15、30、45、60 min，冷卻、補重，搖勻，過濾膜，按“2.3.1.2 ”項下色譜條件進行分析，不同的提取時間制備樣品的五成分測定的峰面積結(jié)果見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時間為30 min時，五成分已趨于提取平衡，其中綠原酸、表兒茶素、喜果苷提取含量已達最大；繼續(xù)增加提取時間表兒茶素降解明顯。最終選擇超聲時間30 min為最佳提取時間。

圖4 不同時間提取的鉤藤葉中5種成分的峰面積 Fig.4 Peak area of five components in U.rhynchophylla leaves extracted at different times

2.3.3 線性關(guān)系考察

將“2.1.1”項制備的混合對照品溶液分別稀釋0、5、10、50、100、250、500倍，得系列混合對照品溶液，按“2.3.1.2”項下色譜條件測定，其中稀釋0倍的混合對照品溶液進樣20、30 μL兩進樣體積；每個濃度分別重復進樣2次，峰面積積分平均值為縱坐標(Y)，分別以綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷的進樣濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，得回歸方程。各成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

表2 五種對照品的回歸方程與線性范圍

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20 μL，按“2.3.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，考察儀器的精密度。結(jié)果顯示，綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷的峰面積RSD分別為0.90%、1.1%、1.7%、1.8%、1.1%。表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 穩(wěn)定性試驗

取鉤藤葉(S8)樣品，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、16、24 h 按“2.3.1.2”項下色譜條件測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷的峰面積RSD分別為0.34%、1.3%、1.2%、0.19%、1.6%。表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4.3 重復性試驗

取鉤藤葉(S8)樣品，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.3.1.2”項下色譜條件測定，考察實驗方法的重復性。結(jié)果顯示，綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、喜果苷的平均含量分別為19.76、4.191、0.745 4、3.036、1.317 mg/g，RSD分別為1.9%、2.7%、2.4%、0.69%、2.3%。表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 加樣回收率試驗

取已知含量的鉤藤葉(S8)約0.1 g，共取6份，精密稱定，分別精密加入5 mL的混合對照品溶液，按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1.2”項下色譜條件分析，記錄色譜圖和峰面積，計算5種成分平均回收率及RSD值。結(jié)果見表3，平均回收率在96.73% ～ 103.50%，RSD均小于3%。

表3 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.3.4.5 樣品測定

取不同產(chǎn)地的鉤藤葉樣品0.2 g，精密稱定，按“2.1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3.1.2”項下色譜條件分析，記錄色譜圖和峰面積，計算5種成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地鉤藤葉含量測定(mg/g)

2.4 聚類分析

為評價不同產(chǎn)地的鉤藤葉測定成分的差異，對12批次鉤藤葉中5種成分的含量測定結(jié)果進行聚類分析。采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯(lián)接聚類方法，采用Euclidean距離作為鉤藤葉樣品的測度，結(jié)果12個產(chǎn)地的鉤藤葉可以分為3類，第一類：S7；第二類：S1、S2、S3、S4、S6、S5；第三類：S10、S11、S8、S9、S12。不同產(chǎn)地鉤藤葉聚類分析樹狀圖見圖5。

圖5 不同產(chǎn)地鉤藤葉聚類分析樹狀圖Fig.5 Tree diagram of cluster analysis of U.rhynchophylla leaves from different localities

3 結(jié)論

對供試品溶液提取方法進行優(yōu)化時，除對不同溶劑、不同提取時間進行了優(yōu)化，還對藥材取樣量進行了考察；結(jié)果表明0.1 g取樣量已經(jīng)具有代表性。另外，還對樣品的提取溶劑體積進行了考察，發(fā)現(xiàn)1∶100的料液比進行提取，五成分含量已經(jīng)趨于提取平衡。

不同產(chǎn)地的鉤藤葉五成分含量測定結(jié)果(見表4)表明：綠原酸在五成分含量中明顯最高，占五成分總量的63%～78%。鉤藤葉五成分含量依產(chǎn)地不同存在明顯的差異，可能與不同產(chǎn)地的環(huán)境差異有關(guān)。根據(jù)12批不同產(chǎn)地鉤藤葉五成分含量的聚類分析結(jié)果(見圖5)，廣東、廣西地區(qū)鉤藤葉聚為第三類；貴州地區(qū)除興義市產(chǎn)地鉤藤葉獨立歸為第一類外，其余的均聚為第二類。從含量看，產(chǎn)于貴州地區(qū)鉤藤葉五成分總含量高于廣東地區(qū)。第二類貴州凱里市、劍河縣等地鉤藤葉，屬于貴州黔東南區(qū)域，而獨立分類興義市位于貴州黔西南區(qū)域，可能是地區(qū)不同種植環(huán)境造成的貴州鉤藤葉五成分差異聚分為了兩類。

鉤藤葉藥用歷史悠久[6]，來源豐富?，F(xiàn)代藥理學研究表明，綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌變、降血脂和降血壓等作用[10]，表兒茶素[11]、金絲桃苷[12]和蘆丁[13]等也具有類似功效；喜果苷具有顯著抗白血病和抑制腫瘤[14]、抗炎[15]等活性。本課題組前期功效研究發(fā)現(xiàn)鉤藤葉除明顯的抗氧化作用，還有抗炎和鎮(zhèn)靜等作用。因此這五個成分是鉤藤葉的主要功效成分，本文建立了鉤藤葉中綠原酸、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷和喜果苷的含量測定方法，為鉤藤葉的綜合開發(fā)利用提供了質(zhì)量控制方法。