趙文婧，喬宏萍

太原師范學(xué)院生物系，晉中 030619

青霉(Penicillium)是自然界中極為常見的的一種菌屬，通過分解有機物來生長，是一類雜食性真菌。它與人類生活息息相關(guān)，既能給人類帶來有益的方面，比如醫(yī)藥中的抗生素——青霉素的使用；也會給自然界帶來一定的危害，例如在微生物實驗室中，它是一種常見的污染菌。在實驗室適當(dāng)?shù)脑黾油庑?，使空氣較為干燥，并讓其生長環(huán)境的溫度處于較低的狀態(tài)，可以有效的減輕青霉的危害。微生物在生長代謝過程中所產(chǎn)生的消化酶，不僅有助于提高動物飼料轉(zhuǎn)化率、消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，還有助于動物的生長；降低海洋動物體內(nèi)膽固醇含量，減少排泄物和生長環(huán)境中氮、有機磷含量，減少對其周邊環(huán)境的污染。

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和生物工程技術(shù)的不斷進步，酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用越來越多。由于酶制劑能夠消除飼料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面作用，提高飼料消化率，改善動物生產(chǎn)性能，降低生產(chǎn)成本，因此日益受到飼料界的重視。

目前，關(guān)于湯姆青霉代謝產(chǎn)物產(chǎn)消化酶活性測定以及抑菌實驗方面的研究鮮為少見。因此，對湯姆青霉產(chǎn)生的消化酶活性進行測定，同時輔以抑菌實驗可以為微生態(tài)制劑產(chǎn)品和飼用酶制劑的的廣泛使用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

PenicilliumthomiiPT95菌株，保存在查氏(CA)斜面上[1]。

PenicilliumthomiiQ1菌株，保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院韓建榮教授惠贈。

1.2 培養(yǎng)基

四種誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：發(fā)酵培養(yǎng)基、酪素瓊脂培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)瓊脂培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖(PDB)液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑

三氯乙酸(TCA)，2%可溶性淀粉溶液，檸檬酸鈉，L-酪氨酸，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，結(jié)晶乙酸鈉，對硝基苯酚，麥芽糖，干酪素，Na2HPO4，HCL，酒石酸鉀鈉，NaOH，苯酚，葡萄糖，NaCO3，冰乙酸，對硝基苯酚棕櫚酸酯，二硝基水楊酸，檸檬酸，福林試劑，NaH2PO4，無水亞硫酸鈉，二硝基亞砜(DMSO)等，均為分析純。

福林試劑：福林試劑原液∶蒸餾水=1∶2。

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：取酪氨酸 0.1 g，加入1 mol/L HCL 6 mL，再用 0.1 mol/L HCL 定容至100 mL，最后用蒸餾水稀釋10倍即為酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

DNS指示劑：稱取18.2 g酒石酸鉀鈉，加入50 mL蒸餾水，50 ℃水浴攪拌溶解，再依次加入水楊酸0.6 g、無水亞硫酸鈉0.5 g、 NaOH 2.1 g、苯酚0.5 g，待全部溶解后，冷卻并用蒸餾水定容至100 mL，4 ℃棕色瓶貯存[2]。

1.4 消化酶活力測定

1.4.1 湯姆青霉產(chǎn)消化酶初篩

將湯姆青霉PT95菌株、Q1菌株分別接種于酪素、CMC-Na、淀粉瓊脂培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)2天，觀察是否產(chǎn)生透明圈完成湯姆青霉發(fā)酵液產(chǎn)生的消化酶的初篩。

1.4.2 湯姆青霉產(chǎn)消化酶復(fù)篩

將初篩中長有透明圈的湯姆青霉PT95、Q1菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、160 rpm振蕩培養(yǎng)96 h，發(fā)酵物4 000 rpm 離心10 min，所獲得的上清液就是待測粗酶液。

1.4.3 蛋白酶活力測定

采用福林-酚試劑法進行蛋白酶活力測定[3,4]。

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取16只試管分別編號，按表1進行操作，每個濃度設(shè)3組重復(fù)；將不含酪氨酸的試管(0)作為空白對照組， 用分光光度計測定680 nm處各濃度梯度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值，橫坐標(biāo)為酪氨酸濃度，縱坐標(biāo)為OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.4.3.2 待測粗酶液的處理

根據(jù)孫建南[5]方法進行蛋白酶活力測定。

蛋白酶活力單位定義：每min水解酪蛋白釋放1 μg酪氨酸的酶量定義為1個蛋白酶單位(U)。

式中：K：吸光常數(shù)

OD：樣品平行試驗的平均光密度

4：試管中反應(yīng)液總體積(mL)

10：反應(yīng)10 min

N：稀釋倍數(shù)

1.4.4 纖維素酶活力測定

采用CMC-Na法測定其纖維素酶的活力[6,7]。

1.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取16支試管分別編號，按表2進行下列的各項操作，每個濃度設(shè)3組重復(fù)，將不含葡萄糖的試管(0)作為空白對照組，在 550 nm處用分光光度計測定各個濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，然后將縱坐標(biāo)定為葡萄糖濃度，橫坐標(biāo)定為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.4.4.2 待測粗酶液的處理

根據(jù)羅佳[8]方法進行纖維素酶活力測定。 纖維素酶活力單位定義：在50 ℃，1 mg酶每min催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖定為一個活力單位(U)。

纖維素酶活力單位(U)=

式中：N一酶液的稀釋倍數(shù)，此處為10

30一糖化所用時間，min

1一反應(yīng)酶液的mL數(shù)

1.4.5 淀粉酶活力測定

采用二硝基水楊酸比色法測定淀粉酶的活力[9-11]。

1.4.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取19支試管分別編號，按表3進行下列的各項操作，每個濃度設(shè)3組重復(fù)， 以不含麥芽糖的試管(0)作為空白對照組調(diào)零，在520 nm處用分光光度計測定各個濃度梯度的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值，將縱坐標(biāo)定為麥芽糖量，橫坐標(biāo)定為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出OD值所對應(yīng)的麥芽糖含量。

表3 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.4.5.2 待測粗酶液的處理

根據(jù)史永昶[11]方法進行淀粉酶活力測定。

淀粉酶活力單位定義：在60 ℃，pH為5.6時，以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需要的酶量為一個麥芽糖單位(MMU)[2]。

淀粉酶活性U按下式計算：

U=麥芽糖含量(mg)×淀粉原液總體積(mL)

×稀釋倍數(shù)/樣品重

1.4.6 脂肪酶活力的測定

采用對硝基苯酚法進行脂肪酶活力測定[12,13]。

1.4.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取16支試管分別編號，按表4進行下列的各項操作，每個濃度設(shè)3組重復(fù)，以不含對硝基苯酚的試管(0)調(diào)零，在410 nm 處用分光光度計測定各個濃度梯度對硝基苯酚的OD值，將橫坐標(biāo)定為對硝基苯酚濃度，縱坐標(biāo)定為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4 脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.4.6.2 待測粗酶液的處理

根據(jù)李蓓[12]方法進行脂肪酶活力測定。

脂肪酶活力單位定義為：在一定條件下，以1min內(nèi)催化水解底物p-NPP產(chǎn)生1 μmol p-NP所需的酶量為1個酶活單位(U)。

脂肪酶活計算公式為：U=1 000×n×V×c/t

其中n為稀釋倍數(shù)

c為所測吸光度值對應(yīng)的濃度(mmol/L);

t為反應(yīng)時間(單位：min);

V為反應(yīng)體系的總體積(單位：L)。

1.5 抑菌實驗

1.5.1 指示菌活化

用移液槍吸取100 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌保存液接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。

1.5.2 湯姆青霉PT95和Q1菌株發(fā)酵液制備

用接種環(huán)挑取湯姆青霉菌株于100 mL PDB培養(yǎng)基中，置于25 ℃、200 rpm振蕩培養(yǎng)5天，留湯姆青霉菌株發(fā)酵濾液備用。

1.5.3 牛津杯法檢測發(fā)酵液的抑菌活性

用移液槍吸取200 μL活化好的各指示菌株于冷卻后的無菌培養(yǎng)皿中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(25 mL)滅菌后冷卻至50 ℃左右時倒入相應(yīng)加入指示菌株的培養(yǎng)皿中，采用牛津杯法檢測發(fā)酵液的抑菌活性，37 ℃下培養(yǎng)12～24 h，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)并用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小。

抑菌率=(抑菌圈直徑-牛津杯直徑)/

抑菌圈直徑×100%

1.5.4 最小抑菌濃度的測定

將湯姆青霉PT95和Q1菌株的發(fā)酵濾液在50 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的五分之一，然后加入95%乙醇沉淀，使其終濃度為75%，4 ℃冰箱放置2天后離心，棄去沉淀，重復(fù)一次，上清液50 ℃下濃縮得浸膏，冷卻干燥成凍干粉備用[14]。

準(zhǔn)確稱取一定量的發(fā)酵液凍干粉，用2.5%的DMSO分別配制成濃度為5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL的樣品溶液[15]。采用牛津杯法用樣品溶液以及最佳抑菌效果的菌種來測定，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各培養(yǎng)皿中菌落形成情況，是否有抑菌圈出現(xiàn)并用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗均設(shè)三次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示實驗數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進行方差分析和相關(guān)性分析，同時用Duncan多重比較法進行多個均數(shù)間的兩兩比較[16]。

2 結(jié)果

2.1 湯姆青霉產(chǎn)蛋白酶活力測定

2.1.1 蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩者線性關(guān)系良好，方程可表示為y=0.011 5x-0.028 9，R2=0.993 8。

圖1 蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protease

當(dāng)OD值為1時，酪氨酸的濃度即吸光常數(shù)K，K=89.47。

2.1.2 酶活力測定

表5 湯姆青霉蛋白酶活力

從表5可以看出，湯姆青霉PT95與Q1之間所產(chǎn)的蛋白酶活力相比差異較顯著(P<0.05)，PT95菌株的蛋白酶活力是Q1菌株的1.38倍。Uttatree 等[17]報道了枯草芽孢桿菌B.subtilisBUU1 液體發(fā)酵24 h 產(chǎn)蛋白酶活力為26.455 U?？梢钥闯鰷非嗝箖芍昃甑牡鞍酌富盍ο鄬^高，后續(xù)可以開展發(fā)酵優(yōu)化實驗進一步提高蛋白酶活力，用于酶制劑的開發(fā)。

2.2 湯姆青霉產(chǎn)纖維素酶活力測定

2.2.1 纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩者線性關(guān)系良好，方程表示為y=0.071 1x-0.001 8，R2=0.999 4。

圖2 纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of cellulase

2.2.2 酶活力測定

表6 湯姆青霉纖維素酶活力

從表6可以看出，湯姆青霉PT95與Q1菌株的纖維素酶活力差異較顯著(P<0.05)，PT95菌株的纖維素酶活力是Q1菌株的1.6倍。真菌是目前工業(yè)生產(chǎn)更是纖維素酶的主要菌種，其中絲狀真菌以木霉屬、曲霉屬和青霉屬為主，纖維素酶產(chǎn)量高于其他微生物，所以被廣泛使用于纖維素酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[18]，但湯姆青霉的纖維素酶活力從實驗結(jié)果來看并不是很高，推測可能和湯姆青霉PT95和Q1菌株主要以產(chǎn)生富含類胡蘿卜素的菌核為主，以產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)度過生長，并不是以產(chǎn)生纖維素酶為主的；也有可能是沒有做發(fā)酵優(yōu)化以提高纖維素酶活力，后續(xù)可以開展此方面研究來看是否有幫助。

2.3 湯姆青霉產(chǎn)淀粉酶活力測定

2.3.1 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3為淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程表示為y=2.983x+0.038 6，R2=0.997 2。

圖3 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of amylase

2.3.2 酶活力測定

表7 湯姆青霉淀粉酶活力

從表7可以看出，湯姆青霉PT95和Q1菌株所產(chǎn)的淀粉酶活力差異不大，PT95菌株的蛋白酶活力僅比Q1菌株大0.277 U。淀粉酶是指分解淀粉及糖原等高分子聚合物的酶的總稱。淀粉酶主要作用于直鏈淀粉、可溶性淀粉和糖原等，根據(jù)其催化特點，通常分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。淀粉為動物生長發(fā)育提供重要的能量來源，而淀粉的消化與吸收離不開淀粉酶的參與和調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，家禽日糧中添加淀粉酶產(chǎn)品，有助于提高家禽對淀粉的消化和利用率；在復(fù)胃動物基礎(chǔ)飼糧中補充適量淀粉酶，對其生產(chǎn)性能的改善具有促進作用。張帥等[19]利用黑曲霉對橘皮進行固體發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶。結(jié)果顯示優(yōu)化后淀粉酶活力達196 U/g，從實驗結(jié)果可以看出湯姆青霉PT95和Q1菌株的產(chǎn)淀粉酶活力并不高，需要進行優(yōu)化并添加發(fā)酵底物。

2.4 湯姆青霉產(chǎn)脂肪酶活力測定

2.4.1 脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4為脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程表示為y=14.791x+0.018 7，R2=0.996。

圖4 脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of lipase

2.4.2 酶活力測定

表8 湯姆青霉脂肪酶活力

從表8可以看出，湯姆青霉PT95與Q1之間產(chǎn)的脂肪酶活力差異極顯著(P<0.01)，PT95菌株的脂肪酶活力是Q1菌株的1.7倍。脂肪酶又稱三酰基甘油?；纸饷浮Ｔ谥敬x過程中能夠?qū)⒅舅獬蓜游锟梢灾苯游盏男》肿游镔|(zhì)。在動物體內(nèi)，脂肪酶控制著脂質(zhì)代謝的整個過程。因此，脂肪酶是動物機體內(nèi)重要的消化酶。用于生產(chǎn)脂肪酶的微生物菌種主要包括黑曲霉和假絲酵母等。何茹等從葡萄中分離出1 株產(chǎn)脂肪酶的內(nèi)生黑曲霉菌株并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化試驗，脂肪酶活力可達18.75 U[20]，湯姆青霉PT95和Q1菌株在沒有優(yōu)化的基礎(chǔ)上脂肪酶活力已有一定的量級，后續(xù)研究中可以對其進行優(yōu)化以提高活力進行酶制劑的開發(fā)利用。

2.5 最佳抑菌效果菌株的篩選

從表9和表10可以看出枯草芽孢桿菌可以作為具有最佳抑菌效果的指示菌株，兩株菌株對其的抑菌率分別可以達到56.37%和53.73%，且抑菌圈直徑也最大。湯姆青霉PT95菌株發(fā)酵濾液對大腸桿菌有抑菌活性但是相比較枯草芽孢桿菌來說活性較低，對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用；Q1菌株發(fā)酵液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，但遠低于枯草芽孢桿菌。從表11可以看出湯姆青霉PT95和Q1發(fā)酵濾液對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為0.64和0.32 mg/mL。

表9 發(fā)酵液對不同指示菌株的抑菌圈直徑

注：每行數(shù)據(jù)中帶不同字母表示差異顯著(P<0.05)，“-”表示沒有出現(xiàn)抑菌圈。

Note:There are significant differences in different letters in each row of data (P<0.05),"-" means no bacteriostatic circle.

表10 發(fā)酵液對不同指示菌株抑菌率大小

注：每行數(shù)據(jù)中帶不同字母表示差異顯著(P<0.05)“-”表示沒有抑菌效果。

Note:There are significant differences in different letters in each line of data (P<0.05),"-" means no bacteriostasis effect.

3 討論

眾所周知，我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。為了防止養(yǎng)殖過程中病害的暴發(fā)，抗生素被大量使用。但是抗生素導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生及殘留藥物通過食物鏈影響人類健康問題日益突出。因此，尋找新型環(huán)保的抗生素替代品成為了當(dāng)下的研究熱點[21，22]。

表11 發(fā)酵液對指示菌的最小抑菌濃度測定

注：“-”表示無抑菌活性或者無抑菌圈；“+”表示菌落的數(shù)量，+的數(shù)量越多，表示菌落數(shù)越多；“*”表示抑菌圈大小，*的數(shù)量越多，表示抑菌圈越大。

Note:"-" means no bacteriostatic activity or no bacteriostatic circle;"+" denotes the number of colonies,and the more + denotes the number of colonies;"*" denotes the size of the bacteriostatic zone,and more “*” denotes larger bacteriostatic zone.

益生菌作為替代抗生素成為新型的飼料添加劑，受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，益生菌具有增強養(yǎng)殖動物免疫力、促進餌料的消化吸收、改善養(yǎng)殖環(huán)境等作用。益生菌本身無毒無害，不殘留，不產(chǎn)生抗藥性，是未來養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用研究重點[23]。隨著飼料添加劑研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等酶制劑在動物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，因此對于益生菌中添加復(fù)合酶制劑將成為新的研究熱點。而青霉在自然界中廣泛存在，與人類生活息息相關(guān)，因此對青霉代謝產(chǎn)物的研究有助于對其理化特性的進一步分析從而更好地發(fā)揮其功能。本實驗所用湯姆青霉PT95和Q1菌株是可以在菌核中積累類胡蘿卜素的[1]，但其能否產(chǎn)生消化酶，并用于飼用酶制劑中有待實驗證實，而本文中選取蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶4種消化酶作為檢測指標(biāo)，對菌株產(chǎn)生的酶活力進行了測定，從實驗結(jié)果中可以看出兩株菌株淀粉酶活力差異不大，而脂肪酶活力差異極顯著，其余兩種酶活力差異顯著，結(jié)果說明湯姆青霉PT95和Q1菌株可以作為益生菌進行飼用酶制劑的開發(fā)利用，整體來看，PT95菌株的消化酶活力大于Q1菌株，可能PT95菌株中有其他作用機制有待探索。

抑菌實驗可以看出湯姆青霉PT95以及Q1菌株對枯草芽孢桿菌都表現(xiàn)出了極強的抑菌活性，下一步可以對其進行優(yōu)化培養(yǎng)以提高兩株菌株的抑菌活性，并可以對其抑菌機理進行深入研究，以期開發(fā)出相關(guān)的抑菌活性產(chǎn)品應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。