楊明浩， 葛曼玲， 付曉璇， 黃賢沖， 崔家俊， 郭志彤， 張夫一

(河北工業(yè)大學電氣工程學院， 省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點實驗室， 河北省電磁場與電器可靠性重點實驗室， 天津 300130)

癲癇(epilepsy)是大腦神經元突發(fā)性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。發(fā)作間期活動(interictal-like activity, ILA)是癲癇發(fā)展過程(epileptogenesis)的重要特征，與神經回路有關[2，3]。在顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)的實驗大鼠模型中，ILA多出現在早期階段[3-5]，這表明致癲癇網絡的構建直接與ILA有關[6]，同時ILA可用來預測癲癇的發(fā)展[7]。ILA的反致癇作用也被提出[8，9]。一般來說，ILA與谷氨酸回路、GABA能回路以及兩種回路之間的不平衡有關[2]。ILA與各種類型癲癇中抑制性GABA能神經元的興奮性和動作電位放電選擇性喪失也有關[10]，ILA傳導還隨GABA能所介導的抑制作用不同而有所差異[10，11]。此外，癲癇中具有重要特征的病態(tài)信號散發(fā)性尖波(sporadic spikes, SSs)是由海馬CA1區(qū)在癲癇發(fā)生過程中興奮性和抑制性突觸間的不平衡所造成[11]。對動物模型和癲癇患者的研究表明：ILA可打斷認知節(jié)律，如內側顳葉(MTL)中的theta節(jié)律。

theta振蕩作為哺乳動物腦神經網絡里最主要的神經元同步化活動的一種，是空間導航和定位、學習、記憶的重要信號頻率，也是研究認知和顳葉癲癇作用機制的關鍵信號之一。海馬結構系大腦半球皮質內側緣的部分，屬于古老皮質，海馬CA1區(qū)的功能主要與空間記憶有關。嗅行時大鼠的海馬CA1區(qū)含有豐富的theta節(jié)律，此外，theta節(jié)律的斷裂可能與海馬區(qū)主要神經元和中間神經元的消亡有關[12-16]，從而造成顳葉癲癇患者(TLE)的認知缺陷，如空間記憶和工作記憶等障礙[12，14]。

前期，我們在匹羅卡品(pilocarpine)致癇嗅行大鼠模型上，應用腦深度電極記錄(SEEG)研究了海馬CA1區(qū)ILA對theta節(jié)律的瞬時抑制作用，發(fā)現：ILA在早期對theta能量和相位穩(wěn)定性損傷最為嚴重。SSs是ILA的一種形式，以相鄰尖波之間(尖波間期)持續(xù)時間較長、并在尖波期后伴隨較長時間無尖波恢復期為特征，常用來研究癲癇尖波與認知狀態(tài)、癲癇波形態(tài)和癲癇發(fā)生過程等因素對腦功能的影響[15]。最近，我們通過時頻分析的量化評估技術，對處于安靜休息狀態(tài)的4位TLE患者立體定向腦電(SEEG)的發(fā)散性尖波在海馬區(qū)CA3和嗅皮層EC腦區(qū)的theta節(jié)律進行研究，發(fā)現：尖波對theta能量有瞬態(tài)的削減作用，并且，尖波間期theta節(jié)律的斷裂與這種削減作用成正比[17]。Theta斷裂自1978年由Winson在大鼠模型上發(fā)現并發(fā)表在Science上以來[14]，一直沒能很好地開展下去，癲癇尖波何時打斷theta節(jié)律以及癲癇發(fā)展進程中theta節(jié)律斷裂的規(guī)律是什么等問題尚沒有很好地解決，主要原因是缺少實驗數據。借鑒立體定向腦電技術，本文使用了癲癇發(fā)展進程中匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，在尖波間期和無尖波恢復期分別研究了癲癇早期和晚期theta節(jié)律斷裂的規(guī)律。本文為癲癇對認知節(jié)律的抑制作用提供了分析依據，對揭示癲癇與認知的關系具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

法國馬賽地中海大學神經科學研究室提供了顳葉癲癇大鼠模型的相關信息和實驗數據。

14只成年Wistar大鼠，均為雄性，體質量(225±20)g。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(20±3) ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實驗的分組與處理

將大鼠在麻醉狀態(tài)時進行開顱手術，將1只直徑約為 0.8 mm的雙極性鋼電極埋入海馬區(qū)的背側，在大鼠顱骨上，將3個不銹鋼皮質電極植入，在其右額皮質和左額皮質，分別將兩只電極植入。小腦埋入參考電極，隨后將顱骨粘合，檢測、記錄大鼠腦電圖；之后腹腔注射癲癇誘發(fā)藥物：匹羅卡品氫氯化物(pilocarpine hydrochloride,310 mg/kg)、30 min后注射大鼠莨菪堿 (scopolamine, 1 mg/kg)。詳細手術過程見 Chauviere 等[13]。當首次在與腦電同步的視頻監(jiān)視儀上觀察到大鼠出現癲癇持續(xù)狀態(tài) (status epilepticus, SE)時，同時在EEG(DeltamedTM)上觀察到持續(xù)的高振幅放電，40 min 后注射安定；癲癇發(fā)生早期大多出現在癲癇持續(xù)狀態(tài)后4～10 d，通過在視頻監(jiān)視儀上觀察大鼠行為同時在EEG上觀察大鼠腦電圖，發(fā)現發(fā)作間期活動 (interictal-like activity, ILA) 在7 d后才正式建立起來，本文定義7 d(7D)為癲癇發(fā)展進程的早期。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后14～16 d，大鼠又一次出現自發(fā)放電，此時EEG為發(fā)作間期活動 (interictal activity, IA)，對應于癲癇持續(xù)狀態(tài)后25～40 d為癲癇發(fā)展進程的晚期，本文取25 d(25D)。其中研究7 d的大鼠有6只，25 d的大鼠有5只，注射前(BI)和7 d，25 d無尖波恢復期的大鼠均是3只。所有分析以1 h數據為一個記錄段。因為在早期，ILA放電不頻繁，一天中在每只大鼠上至少取2個記錄段用于計算。但在晚期，ILA放電頻繁，一天中在每只大鼠上取 1 個記錄段用于計算?？傊ＷC在每只大鼠上所取的記錄段總數比較均勻，即每只大鼠尖波總數至少大于30段。D7在6只大鼠腦電上取了224個尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時間分別是14.21和3.7 s；D25在5只大鼠腦電上取了290個尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時間分別是12.89 s和3.56 s。尖波腦電后有較長時間的無尖波恢復期，尖波腦電后2 h后取一個記錄段。文章的記錄段皆為白天，無夜間睡眠節(jié)律的影響。D7在3只大鼠上取恢復期腦電，最長和最短計算時間分別是20.37 s和5.14 s；D25也在3只大鼠上取恢復期腦電，最長和最短計算時間分別是18.65 s和4.96 s。最后需要說明的是，注射前在3只大鼠取腦電，最長和最短計算時間分別是35.38 s和7.69 s。

1.3 大鼠腦電極植入的方法與腦電圖的觀察

Gabor小波變換能夠較好地兼顧信號在時域和頻域中的分辨率，可獲取theta節(jié)律的時頻能量，并可直接觀察theta節(jié)律是否具有時間連續(xù)性。Gabor小波變換可用下式描述：

(1)

公式中，復數Wx(t0,f)代表信號x(t)在頻率為f時間為t0時刻的正交信息，η代表中心頻率，復數Wx(t0,f)實部和虛部的平方和為小波能量值。選取3.5 s計算時長，選取的時長和之前的研究一致[15、17]，可獲得Gabor小波時頻能量。當進行能量分析時，小波能量對段平均，可直接觀察theta能量在尖波附近的動態(tài)變化。在時頻分析圖中，當能量突然消失或變得很低，成為背景顏色時，當背景顏色持續(xù)時間達到200 ms及以上時認為該段(以350 ms為一段)節(jié)律出現斷裂，選取的時長和之前在癲癇尖波附近350 ms的研究一致[15，17]。計算斷裂的段數與總段數的比值，定義為theta節(jié)律斷裂比，用來衡量尖波間期或無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂程度。本文以t檢驗為統計學差異。

沒有偽差的腦電圖中，尖波幅值要高于內在 EEG (intrinsic EEG) 幅值的10倍以上。為獲取內在腦活動，需要去除尖波的作用，尖波的開始和結束由起始點(onset)和終止點(offset)由經驗豐富的法國神經學專家根據EEG上癲癇尖波前后基線 (baseline) 來確定。在尖波間期，我們選取D7和D25的每只大鼠的前一個尖波的offset到后一個尖波的onset的時間序列；在注射前和無尖波恢復期，我們遍歷了每只大鼠嗅行時腦電的時間序列，如圖1所示。值得說明的是那些幅度較小的尖波(如圖1C所示)也會對theta節(jié)律斷裂分析造成影響需要去除：在腦電分析軟件EEGLAB中找到小尖波對應的時間刻度，換算成在小波時頻能量對應的時間刻度，在進行能量分析時，去除該時間段，就可以去除這個小尖波的影響。文章所用段數歸納如下(表1)：在尖波間期，D7一共419段，發(fā)生斷裂數是126段；D25一共3729段，發(fā)生斷裂數是906段；注射前一共1290段，發(fā)生斷裂數是75；在無尖波恢復期，D7一共420段，發(fā)生斷裂數是98段；D25一共270段，發(fā)生斷裂數是61段。

2 結果

2.1 尖波間期theta節(jié)律斷裂

D7的尖波間期的波形圖和對應的theta節(jié)律時頻能量圖如圖所示(圖2A上)，與注射前相比，此期間的theta節(jié)律能量斷裂比相較于注射前增加了近6倍，如表格1所示。而D25(圖2A下)，盡管與注射前相比，theta節(jié)律仍然有很大的斷裂程度，但是相對于D7來說，斷裂程度趨緩，斷裂比降低了6%左右(表1)。此外，尖波間期發(fā)生較大程度的theta節(jié)律斷裂表明尖波是導致theta節(jié)律斷裂的直接原因。

Fig.1EEG during epileptogenesis

A: Period between two adjacent spikes; B: Before-injections(BI) period and recovery period without spikes; C: EEG connotative a tiny spike(between two gray lines)

2.2 無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂

注射前腦電波形和theta節(jié)律時頻能量表現為能量連續(xù)和良好的質量，發(fā)生斷裂的段數比較少，斷裂情形微乎其微，如圖所示(圖2B上)，反映出健康大鼠theta節(jié)律呈現良好狀態(tài)，斷裂比僅5.81%，如表1所示。D7的無尖波恢復期腦電出現較大比例的theta節(jié)律斷裂(圖2C上)，斷裂比高達 27.14%，與D7的尖波間期相當。

D25的無尖波恢復期的斷裂程度(圖2C下)卻較D7有所降低(22.59%)，如表1所示，但與D25的尖波間期相當。

3 討論

本文分析了顳葉癲癇大鼠在尖波間期和無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂在癲癇發(fā)展進程中的規(guī)律，得出如下結論：(1)癲癇尖波是theta節(jié)律斷裂的直接原因；(2)即便是在無尖波恢復期，theta節(jié)律斷裂仍然持續(xù)。

Fig.2Examples of theta rhythms continuity and breakage in EEG and time-frequency plane during each period

A: Period between two adjacent spikes on day 7 and day 25; B: Before injections; C: Recovery period without spikes

Tab.1The numbers of disrupted theta rhythms and breakage ratio(%) in different periods

Before injectionsInterspike periodRecovery period without spikesD7D25D7D25Loss7512690611461Breakage ratio(%)5.8130.7024.3027.1422.59

在癲癇網絡中，突觸驅動的不平衡是產生癲癇尖波的主要原因，它使得網絡易于產生癲癇發(fā)作，并便于癲癇波的傳導[3]，以持續(xù)增強的興奮性或持續(xù)降低的抑制性為特征的網絡超興奮 (hyper-excitation)狀態(tài)是這種不平衡作用的主要結果。尖波間期theta節(jié)律的斷裂很可能與這種不平衡所產生的影響有關。在D7，尖波對慢GABA能神經元的抑制性造成很大的傷害[3]，致使GABA能網絡交互性大大降低，導致theta節(jié)律斷裂比很大。相反，在D25，谷氨酸突觸調制作用有所增強[3，18]，即興奮性有所增強，因此，斷裂比相對D7有所減小。本文揭示的早期theta節(jié)律斷裂最為嚴重的分析結果與Chauvièha等發(fā)現的癲癇早期大鼠對空間位置記憶功能受傷害最大有關聯[13]，也與我們前期在尖波附近瞬態(tài)(350 ms)分析得出的規(guī)律是一致的[15，16]。此外，研究表明：嗅行速度和焦慮情緒等因素會影響theta節(jié)律，Chauvièha等研究說明了癲癇發(fā)生晚期比早期嗅行速度要低，與本文分析的theta節(jié)律的斷裂趨勢一致，但在注射前大鼠嗅行速度更低，而本文分析的theta節(jié)律斷裂較少，具有良好的質量，因此，嗅行速度和焦慮情緒不是導致theta節(jié)律斷裂的直接因素，癲癇形成了CA1神經元網絡超同步是主要原因。本文研究結論和癲癇導致的神經元損傷會導致海馬theta節(jié)律能量降低直至斷裂的結論是一致的[10，11]。文章所取無尖波期為發(fā)散尖波停止出現后的一段1 h腦電，在這1 h時間內不僅沒有尖波發(fā)放，也沒有bursts發(fā)放，更沒有seizures，我們斷定該無尖波期theta節(jié)律的斷裂由前面的尖波引起。無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂與尖波間期相當，可能與癲癇導致CA1網絡重組有關[19]，盡管此期間沒有尖波，但重組了的CA1網絡狀態(tài)無法恢復，導致theta節(jié)律的損傷持續(xù)。今后的工作將在虛擬腦模型上用理論方法研究theta節(jié)律斷裂的深層機制。