楊明浩， 葛曼玲， 付曉璇， 黃賢沖， 崔家俊， 郭志彤， 張夫一

(河北工業(yè)大學電氣工程學院， 省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點實驗室， 河北省電磁場與電器可靠性重點實驗室， 天津 300130)

癲癇(epilepsy)是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。發(fā)作間期活動(interictal-like activity, ILA)是癲癇發(fā)展過程(epileptogenesis)的重要特征，與神經(jīng)回路有關[2，3]。在顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)的實驗大鼠模型中，ILA多出現(xiàn)在早期階段[3-5]，這表明致癲癇網(wǎng)絡的構建直接與ILA有關[6]，同時ILA可用來預測癲癇的發(fā)展[7]。ILA的反致癇作用也被提出[8，9]。一般來說，ILA與谷氨酸回路、GABA能回路以及兩種回路之間的不平衡有關[2]。ILA與各種類型癲癇中抑制性GABA能神經(jīng)元的興奮性和動作電位放電選擇性喪失也有關[10]，ILA傳導還隨GABA能所介導的抑制作用不同而有所差異[10，11]。此外，癲癇中具有重要特征的病態(tài)信號散發(fā)性尖波(sporadic spikes, SSs)是由海馬CA1區(qū)在癲癇發(fā)生過程中興奮性和抑制性突觸間的不平衡所造成[11]。對動物模型和癲癇患者的研究表明：ILA可打斷認知節(jié)律，如內側顳葉(MTL)中的theta節(jié)律。

theta振蕩作為哺乳動物腦神經(jīng)網(wǎng)絡里最主要的神經(jīng)元同步化活動的一種，是空間導航和定位、學習、記憶的重要信號頻率，也是研究認知和顳葉癲癇作用機制的關鍵信號之一。海馬結構系大腦半球皮質內側緣的部分，屬于古老皮質，海馬CA1區(qū)的功能主要與空間記憶有關。嗅行時大鼠的海馬CA1區(qū)含有豐富的theta節(jié)律，此外，theta節(jié)律的斷裂可能與海馬區(qū)主要神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的消亡有關[12-16]，從而造成顳葉癲癇患者(TLE)的認知缺陷，如空間記憶和工作記憶等障礙[12，14]。

前期，我們在匹羅卡品(pilocarpine)致癇嗅行大鼠模型上，應用腦深度電極記錄(SEEG)研究了海馬CA1區(qū)ILA對theta節(jié)律的瞬時抑制作用，發(fā)現(xiàn)：ILA在早期對theta能量和相位穩(wěn)定性損傷最為嚴重。SSs是ILA的一種形式，以相鄰尖波之間(尖波間期)持續(xù)時間較長、并在尖波期后伴隨較長時間無尖波恢復期為特征，常用來研究癲癇尖波與認知狀態(tài)、癲癇波形態(tài)和癲癇發(fā)生過程等因素對腦功能的影響[15]。最近，我們通過時頻分析的量化評估技術，對處于安靜休息狀態(tài)的4位TLE患者立體定向腦電(SEEG)的發(fā)散性尖波在海馬區(qū)CA3和嗅皮層EC腦區(qū)的theta節(jié)律進行研究，發(fā)現(xiàn)：尖波對theta能量有瞬態(tài)的削減作用，并且，尖波間期theta節(jié)律的斷裂與這種削減作用成正比[17]。Theta斷裂自1978年由Winson在大鼠模型上發(fā)現(xiàn)并發(fā)表在Science上以來[14]，一直沒能很好地開展下去，癲癇尖波何時打斷theta節(jié)律以及癲癇發(fā)展進程中theta節(jié)律斷裂的規(guī)律是什么等問題尚沒有很好地解決，主要原因是缺少實驗數(shù)據(jù)。借鑒立體定向腦電技術，本文使用了癲癇發(fā)展進程中匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，在尖波間期和無尖波恢復期分別研究了癲癇早期和晚期theta節(jié)律斷裂的規(guī)律。本文為癲癇對認知節(jié)律的抑制作用提供了分析依據(jù)，對揭示癲癇與認知的關系具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

法國馬賽地中海大學神經(jīng)科學研究室提供了顳葉癲癇大鼠模型的相關信息和實驗數(shù)據(jù)。

14只成年Wistar大鼠，均為雄性，體質量(225±20)g。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(20±3) ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實驗的分組與處理

將大鼠在麻醉狀態(tài)時進行開顱手術，將1只直徑約為 0.8 mm的雙極性鋼電極埋入海馬區(qū)的背側，在大鼠顱骨上，將3個不銹鋼皮質電極植入，在其右額皮質和左額皮質，分別將兩只電極植入。小腦埋入?yún)⒖茧姌O，隨后將顱骨粘合，檢測、記錄大鼠腦電圖；之后腹腔注射癲癇誘發(fā)藥物：匹羅卡品氫氯化物(pilocarpine hydrochloride,310 mg/kg)、30 min后注射大鼠莨菪堿 (scopolamine, 1 mg/kg)。詳細手術過程見 Chauviere 等[13]。當首次在與腦電同步的視頻監(jiān)視儀上觀察到大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài) (status epilepticus, SE)時，同時在EEG(DeltamedTM)上觀察到持續(xù)的高振幅放電，40 min 后注射安定；癲癇發(fā)生早期大多出現(xiàn)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后4～10 d，通過在視頻監(jiān)視儀上觀察大鼠行為同時在EEG上觀察大鼠腦電圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)作間期活動 (interictal-like activity, ILA) 在7 d后才正式建立起來，本文定義7 d(7D)為癲癇發(fā)展進程的早期。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后14～16 d，大鼠又一次出現(xiàn)自發(fā)放電，此時EEG為發(fā)作間期活動 (interictal activity, IA)，對應于癲癇持續(xù)狀態(tài)后25～40 d為癲癇發(fā)展進程的晚期，本文取25 d(25D)。其中研究7 d的大鼠有6只，25 d的大鼠有5只，注射前(BI)和7 d，25 d無尖波恢復期的大鼠均是3只。所有分析以1 h數(shù)據(jù)為一個記錄段。因為在早期，ILA放電不頻繁，一天中在每只大鼠上至少取2個記錄段用于計算。但在晚期，ILA放電頻繁，一天中在每只大鼠上取 1 個記錄段用于計算。總之，保證在每只大鼠上所取的記錄段總數(shù)比較均勻，即每只大鼠尖波總數(shù)至少大于30段。D7在6只大鼠腦電上取了224個尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時間分別是14.21和3.7 s；D25在5只大鼠腦電上取了290個尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時間分別是12.89 s和3.56 s。尖波腦電后有較長時間的無尖波恢復期，尖波腦電后2 h后取一個記錄段。文章的記錄段皆為白天，無夜間睡眠節(jié)律的影響。D7在3只大鼠上取恢復期腦電，最長和最短計算時間分別是20.37 s和5.14 s；D25也在3只大鼠上取恢復期腦電，最長和最短計算時間分別是18.65 s和4.96 s。最后需要說明的是，注射前在3只大鼠取腦電，最長和最短計算時間分別是35.38 s和7.69 s。

1.3 大鼠腦電極植入的方法與腦電圖的觀察

Gabor小波變換能夠較好地兼顧信號在時域和頻域中的分辨率，可獲取theta節(jié)律的時頻能量，并可直接觀察theta節(jié)律是否具有時間連續(xù)性。Gabor小波變換可用下式描述：

(1)

公式中，復數(shù)Wx(t0,f)代表信號x(t)在頻率為f時間為t0時刻的正交信息，η代表中心頻率，復數(shù)Wx(t0,f)實部和虛部的平方和為小波能量值。選取3.5 s計算時長，選取的時長和之前的研究一致[15、17]，可獲得Gabor小波時頻能量。當進行能量分析時，小波能量對段平均，可直接觀察theta能量在尖波附近的動態(tài)變化。在時頻分析圖中，當能量突然消失或變得很低，成為背景顏色時，當背景顏色持續(xù)時間達到200 ms及以上時認為該段(以350 ms為一段)節(jié)律出現(xiàn)斷裂，選取的時長和之前在癲癇尖波附近350 ms的研究一致[15，17]。計算斷裂的段數(shù)與總段數(shù)的比值，定義為theta節(jié)律斷裂比，用來衡量尖波間期或無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂程度。本文以t檢驗為統(tǒng)計學差異。

沒有偽差的腦電圖中，尖波幅值要高于內在 EEG (intrinsic EEG) 幅值的10倍以上。為獲取內在腦活動，需要去除尖波的作用，尖波的開始和結束由起始點(onset)和終止點(offset)由經(jīng)驗豐富的法國神經(jīng)學專家根據(jù)EEG上癲癇尖波前后基線 (baseline) 來確定。在尖波間期，我們選取D7和D25的每只大鼠的前一個尖波的offset到后一個尖波的onset的時間序列；在注射前和無尖波恢復期，我們遍歷了每只大鼠嗅行時腦電的時間序列，如圖1所示。值得說明的是那些幅度較小的尖波(如圖1C所示)也會對theta節(jié)律斷裂分析造成影響需要去除：在腦電分析軟件EEGLAB中找到小尖波對應的時間刻度，換算成在小波時頻能量對應的時間刻度，在進行能量分析時，去除該時間段，就可以去除這個小尖波的影響。文章所用段數(shù)歸納如下(表1)：在尖波間期，D7一共419段，發(fā)生斷裂數(shù)是126段；D25一共3729段，發(fā)生斷裂數(shù)是906段；注射前一共1290段，發(fā)生斷裂數(shù)是75；在無尖波恢復期，D7一共420段，發(fā)生斷裂數(shù)是98段；D25一共270段，發(fā)生斷裂數(shù)是61段。

2 結果

2.1 尖波間期theta節(jié)律斷裂

D7的尖波間期的波形圖和對應的theta節(jié)律時頻能量圖如圖所示(圖2A上)，與注射前相比，此期間的theta節(jié)律能量斷裂比相較于注射前增加了近6倍，如表格1所示。而D25(圖2A下)，盡管與注射前相比，theta節(jié)律仍然有很大的斷裂程度，但是相對于D7來說，斷裂程度趨緩，斷裂比降低了6%左右(表1)。此外，尖波間期發(fā)生較大程度的theta節(jié)律斷裂表明尖波是導致theta節(jié)律斷裂的直接原因。

Fig.1EEG during epileptogenesis

A: Period between two adjacent spikes; B: Before-injections(BI) period and recovery period without spikes; C: EEG connotative a tiny spike(between two gray lines)

2.2 無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂

注射前腦電波形和theta節(jié)律時頻能量表現(xiàn)為能量連續(xù)和良好的質量，發(fā)生斷裂的段數(shù)比較少，斷裂情形微乎其微，如圖所示(圖2B上)，反映出健康大鼠theta節(jié)律呈現(xiàn)良好狀態(tài)，斷裂比僅5.81%，如表1所示。D7的無尖波恢復期腦電出現(xiàn)較大比例的theta節(jié)律斷裂(圖2C上)，斷裂比高達 27.14%，與D7的尖波間期相當。

D25的無尖波恢復期的斷裂程度(圖2C下)卻較D7有所降低(22.59%)，如表1所示，但與D25的尖波間期相當。

3 討論

本文分析了顳葉癲癇大鼠在尖波間期和無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂在癲癇發(fā)展進程中的規(guī)律，得出如下結論：(1)癲癇尖波是theta節(jié)律斷裂的直接原因；(2)即便是在無尖波恢復期，theta節(jié)律斷裂仍然持續(xù)。

Fig.2Examples of theta rhythms continuity and breakage in EEG and time-frequency plane during each period

A: Period between two adjacent spikes on day 7 and day 25; B: Before injections; C: Recovery period without spikes

Tab.1The numbers of disrupted theta rhythms and breakage ratio(%) in different periods

Before injectionsInterspike periodRecovery period without spikesD7D25D7D25Loss7512690611461Breakage ratio(%)5.8130.7024.3027.1422.59

在癲癇網(wǎng)絡中，突觸驅動的不平衡是產(chǎn)生癲癇尖波的主要原因，它使得網(wǎng)絡易于產(chǎn)生癲癇發(fā)作，并便于癲癇波的傳導[3]，以持續(xù)增強的興奮性或持續(xù)降低的抑制性為特征的網(wǎng)絡超興奮 (hyper-excitation)狀態(tài)是這種不平衡作用的主要結果。尖波間期theta節(jié)律的斷裂很可能與這種不平衡所產(chǎn)生的影響有關。在D7，尖波對慢GABA能神經(jīng)元的抑制性造成很大的傷害[3]，致使GABA能網(wǎng)絡交互性大大降低，導致theta節(jié)律斷裂比很大。相反，在D25，谷氨酸突觸調制作用有所增強[3，18]，即興奮性有所增強，因此，斷裂比相對D7有所減小。本文揭示的早期theta節(jié)律斷裂最為嚴重的分析結果與Chauvièha等發(fā)現(xiàn)的癲癇早期大鼠對空間位置記憶功能受傷害最大有關聯(lián)[13]，也與我們前期在尖波附近瞬態(tài)(350 ms)分析得出的規(guī)律是一致的[15，16]。此外，研究表明：嗅行速度和焦慮情緒等因素會影響theta節(jié)律，Chauvièha等研究說明了癲癇發(fā)生晚期比早期嗅行速度要低，與本文分析的theta節(jié)律的斷裂趨勢一致，但在注射前大鼠嗅行速度更低，而本文分析的theta節(jié)律斷裂較少，具有良好的質量，因此，嗅行速度和焦慮情緒不是導致theta節(jié)律斷裂的直接因素，癲癇形成了CA1神經(jīng)元網(wǎng)絡超同步是主要原因。本文研究結論和癲癇導致的神經(jīng)元損傷會導致海馬theta節(jié)律能量降低直至斷裂的結論是一致的[10，11]。文章所取無尖波期為發(fā)散尖波停止出現(xiàn)后的一段1 h腦電，在這1 h時間內不僅沒有尖波發(fā)放，也沒有bursts發(fā)放，更沒有seizures，我們斷定該無尖波期theta節(jié)律的斷裂由前面的尖波引起。無尖波恢復期theta節(jié)律斷裂與尖波間期相當，可能與癲癇導致CA1網(wǎng)絡重組有關[19]，盡管此期間沒有尖波，但重組了的CA1網(wǎng)絡狀態(tài)無法恢復，導致theta節(jié)律的損傷持續(xù)。今后的工作將在虛擬腦模型上用理論方法研究theta節(jié)律斷裂的深層機制。