王根桃， 林 毅， 林賽云

(1. 福建省腫瘤醫(yī)院口腔科， 福州 350014； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院口腔科， 福州 350000)

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，據(jù)2015年IDF統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)約有1.1億糖尿病患者，位居世界之首[1]。糖尿病患者易產(chǎn)生多種并發(fā)癥，其中，種植體周?chē)资翘悄虿』颊呖谇环N植后最易發(fā)生的并發(fā)癥之一，其可導(dǎo)致種植體周?chē)?、硬組織受到炎癥性損害，促進(jìn)牙槽骨吸收，使得傷口愈合減慢、并增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[2]。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙髓組織中的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具備自我更新、多向分化、高度增殖等特點(diǎn)，在牙體牙髓修復(fù)、組織種植再生方面具有重要的應(yīng)用前景[3]。然而，目前關(guān)于DPSCs治療種植體周?chē)椎膶?shí)驗(yàn)研究較少，其治療機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)擬以糖尿病Beagle犬為研究對(duì)象，建立糖尿病后種植體周?chē)啄Ｐ?，采用地塞米松噴霧劑和DPSCs聯(lián)合干預(yù)，明確其治療效果并探討可能機(jī)制，對(duì)于糖尿病種植體周?chē)椎呐R床防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Beagle犬9只，清潔級(jí)，12月齡，體重10～12 kg左右，購(gòu)自南京軍區(qū)福州總醫(yī)院。經(jīng)檢查，所購(gòu)Beagle犬牙齒排列整齊、牙列完整，無(wú)慢性牙周病及齲齒病，咬合能力正常，購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2 試劑與主要儀器

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；Strol-1、CD146單克隆抗體、四氧嘧啶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖測(cè)量?jī)x、血糖試紙購(gòu)自美國(guó)Johnson公司；Bio-Oss骨粉、Bio-Gide膜購(gòu)自瑞士蓋氏公司；MD-20種植機(jī)、鈦種植體購(gòu)自瑞士Straumann公司；MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；5417R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 DPSCs分離與培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)方法[4]，取Beagle犬上下頜雙側(cè)第2、4前磨牙作為DPSCs來(lái)源及種植手術(shù)區(qū)域。將牙置于預(yù)冷的PBS中，剪開(kāi)牙冠及牙根，取出牙髓并充分剪碎，置于含膠原酶和Dispase酶的混合消化液中，培養(yǎng)箱中消化40 min后離心，收集細(xì)胞，加α-MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清、1%雙抗及0.25%谷氨酰胺)重懸，接種至培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)瓶于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)。

1.4 DPSCs的鑒定

采用免疫熒光法檢測(cè)DPSCs標(biāo)記物Strol-1、CD146，鑒定是否為DPSCs，具體操作如下：將細(xì)胞接種至96孔板中，培養(yǎng)2～3 d后，棄掉孔內(nèi)液體，預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗2次；采用4%多聚甲醛液固定細(xì)胞30 min，潤(rùn)洗，加入0.25% Triton-100處理15 min，潤(rùn)洗，再經(jīng)5% BSA封閉30 min，潤(rùn)洗完成后，各孔加入Strol-1或CD146單克隆抗體稀釋液(1∶100)，置于4℃濕盒中避光孵育過(guò)夜；次日棄液，預(yù)冷PBS洗3次，加入熒光二抗稀釋液(1∶200)，37℃避光孵育1 h；棄液，預(yù)冷PBS洗3次，加入DAPI工作液，室溫下避光孵育15 min，棄液，潤(rùn)洗3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況，分析DPSCs純度。

1.5 糖尿病Beagle犬種植體周?chē)啄Ｐ偷慕?/h3>

動(dòng)物于造模前禁食12 h，給予一次性腹腔注射四氧嘧啶(50 mg/kg)建立糖尿病模型，于注射72 h后測(cè)定動(dòng)物空腹血糖值，空腹血糖值≥13.90 mmol/L視為糖尿病犬。此后連續(xù)正常飼養(yǎng)4周，每周監(jiān)測(cè)動(dòng)物血糖值，其值穩(wěn)定在13.90 mmol/L以上說(shuō)明糖尿病Beagle犬模型建立成功。然后，將Beagle犬所有拔牙位點(diǎn)植入種植體，種植后8周達(dá)到骨結(jié)合程度，于種植體位點(diǎn)建立種植體周?chē)赘腥灸Ｐ蚚5]。根據(jù)臨床種植體周?chē)椎脑\斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察種植體周?chē)浗M織是否腫脹發(fā)紅、探診出血、種植體周?chē)Y(jié)合上皮附著喪失等癥狀，判斷模型是否建立成功。

1.6 動(dòng)物分組與給藥

9只Beagle犬隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組，每組3只。其中對(duì)照組、模型組均在牙損區(qū)域放置0.3 g Bio-Oss骨粉+30 μl PBS+Bio-Gide膜覆蓋處理，治療組給予地塞米松噴霧(tid)+0.3 g Bio-Oss骨粉+30 μl DPSCs(107cells/ml)+Bio-Gide膜覆蓋處理，每周給藥1次，持續(xù)12周。給藥完成后，采用濾紙條法收集動(dòng)物齦溝液，于12 000 r/min離心15 min后收集上清液，-20℃保存待測(cè)。

1.7 骨高度檢測(cè)

分別于造模前和藥物治療完成后采用平行透照技術(shù)拍攝X線(xiàn)片，取正側(cè)位及局部牙片，觀察分析各組Beagle犬種植體近、遠(yuǎn)中邊緣骨高度的變化。

1.8 Elisa實(shí)驗(yàn)

采用Elisa試劑盒檢測(cè)各組Beagle犬齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β3的含量，整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，于450 nm處檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各指標(biāo)濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果2.1 DPSCs一般形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果

顯微鏡下觀察顯示，DPSCs多數(shù)呈圓形、橢圓形，細(xì)胞透亮有光澤，細(xì)胞間分布較均勻，排列無(wú)明顯規(guī)則；Strol-1、CD146均是DPSCs的特異性標(biāo)記物，其中Strol-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，CD146主要表達(dá)于胞漿中，免疫熒光染色后，可見(jiàn)特異性熒光在細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果表明DPSCs達(dá)85%以上(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

2.2 各組Beagle犬近、遠(yuǎn)中邊緣骨高度比較

與對(duì)照組比較，模型組Beagle犬種植體近、遠(yuǎn)中邊緣骨高度均明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，治療組近、遠(yuǎn)中邊緣骨高度均明顯增加(P<0.05，表1)。

2.3 各組Beagle犬齦溝液炎癥因子含量比較

與對(duì)照組比較，模型組Beagle犬齦溝液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著上升(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，治療組Beagle犬齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著下降(P<0.01或P<0.05)，其中以TNF-α下降最為明顯(P<0.01，表2)。

GroupNear-middle marginal bone densityDistal marginal bone density Before treatmentAfter treatmentBefore treatmentAfter treatmentControl2.76±0.622.75±0.512.82±0.562.82±0.50Model2.75±0.712.35±0.84?2.83±0.65 2.51±0.46?Treatment2.75±0.752.62±0.42#2.84±0.59 2.70±0.61#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

GroupTNF-αIL-1βIL-6Control53.21±8.1235.54±7.5232.21±7.01Model77.22±11.20??61.41±8.13?? 50.14±8.24?Treatment58.18±7.52## 46.17±8.68# 41.22±6.88#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.4 各組Beagle犬齦溝液TGF-β3含量比較

與對(duì)照組比較，模型組Beagle犬齦溝液中TGF-β3含量顯著下降(P<0.01)；而在給予地塞米松聯(lián)合DPSCs治療后，齦溝液中TGF-β3含量明顯回升(P<0.01，表3)。

GroupTGF-β3Control284.87±55.63Model198.84±52.91??Treatment253.67±63.91##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3 討論

糖尿病已成為種植體周?chē)椎年P(guān)鍵危險(xiǎn)因素之一。研究表明，糖尿病狀態(tài)下持續(xù)高血糖易損害正常的骨代謝，影響口腔種植患者種植體骨結(jié)合，并激活周?chē)傺仔砸蜃?，?dǎo)致種植體周?chē)椎陌l(fā)生[6]。位于牙髓組織中的DPSCs是具有高度分化能力的成體干細(xì)胞，能向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，在牙體修復(fù)、種植再生方面具有重要的應(yīng)用前景[7]。本研究以糖尿病種植體周?chē)譈eagle犬為研究載體，經(jīng)地塞米松噴霧聯(lián)合犬來(lái)源的DPSCs治療12周后，通過(guò)評(píng)價(jià)牙區(qū)骨高度及齦溝液中炎癥因子及TGF-β3的含量，旨在探討DPSCs的潛在療效機(jī)制。

Beagle犬是一種常用的非嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有易飼養(yǎng)、性格溫順、價(jià)格經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，由于其牙槽骨形態(tài)、骨密度與人接近，通常作為口腔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的首選。本實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔注射四氧嘧啶的方法建立糖尿病Beagle犬模型，并持續(xù)觀察4周時(shí)間，確定糖尿病模型建立成功后，于拔牙區(qū)植入種植體，種植后8周于種植體位點(diǎn)采用菌斑控制法建立種植體周?chē)赘腥灸Ｐ?，通過(guò)平行投照X線(xiàn)片分析，確定模型建立成功。齦溝液是由溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體，其內(nèi)容物主要由牙周組織釋放，對(duì)于牙周疾病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究具有重要指導(dǎo)意義[8]。

研究表明，在種植體周?chē)撞±項(xiàng)l件下，齦溝液中炎癥因子含量顯著上升，嚴(yán)重影響牙骨的恢復(fù)并增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[9]。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥介導(dǎo)的經(jīng)典指標(biāo)，TNF-α主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體損傷期間最早作出應(yīng)答的介質(zhì)之一，可引起并加重機(jī)體全身炎癥反應(yīng)；IL-1β、IL-6同屬于白細(xì)胞介素中促炎性因子，介導(dǎo)炎癥發(fā)生的重要過(guò)程，其水平升高通常預(yù)示著感染的發(fā)生[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病Beagle犬種植體周?chē)l溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量較對(duì)照組均明顯上升，炎癥現(xiàn)象明顯，經(jīng)地塞米松噴霧聯(lián)合DPSCs治療后，炎癥程度顯著減輕。

TGF-β是一種多功能性生長(zhǎng)因子，主要在炎癥調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、腫瘤侵襲和神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。TGF-β主要有三個(gè)亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，其中TGF-β3來(lái)源于骨質(zhì)，能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)又能抑制破骨細(xì)胞的合成，在牙體修復(fù)再生中起重要作用[13]。齦溝液中TGF-β3水平能在一定程度上決定牙體種植后的恢復(fù)速率[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組Beagle犬齦溝液TGF-β3含量較對(duì)照組顯著下降，而在給予治療后其含量明顯回升，說(shuō)明是通過(guò)增加TGF-β3水平發(fā)揮治療作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松聯(lián)合DPSCs治療對(duì)糖尿病種植體周?chē)子忻黠@的改善作用，其作用可能與降低炎癥反應(yīng)，增加TGF-β3水平有關(guān)，但尚不明確炎癥因子的減少是否與TGF-β3水平的升高有直接聯(lián)系。本研究闡明地塞米松聯(lián)合DPSCs治療糖尿病種植體周?chē)椎牟糠謾C(jī)制，但其更多潛在的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。