史佳林， 夏 穎， 花 月， 張可佳， 陳 濤， 姜 巖△

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 江蘇 蘇州 215123； 2. 江蘇省老年疾病預(yù)防轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室， 蘇州大學(xué)， 江蘇 蘇州 215123)

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是一種易揮發(fā)的無色液體，作為清洗劑在電子、電鍍等行業(yè)長期廣泛應(yīng)用，也常用作萃取溶劑和高分子化合物的生產(chǎn)原料等。由于其廣泛應(yīng)用及其所具有的揮發(fā)性和微量溶水性，三氯乙烯已成為全球最重要的有機(jī)污染物之一，廣泛存在于大氣、土壤和地下水中[1]。對我國城市淺層地下水有機(jī)污染的研究也表明三氯乙烯是主要的污染物，2012年國際癌癥研究組織(International Agency for Research on Cancer, IARC)將三氯乙烯從2A類(人類可能致癌物)升級為I類(人類致癌物)[2]。

先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)是指胚胎期心血管發(fā)育異常而累及心功能的一組先天性畸形，新生兒的發(fā)病率為4.05%～12.3%，嚴(yán)重危害幼兒健康，越來越多的證據(jù)表明除遺傳因素外，環(huán)境因素是先心病發(fā)生的主要原因[3]。Goldberg等人首次報道，正常孕婦孕期接觸TCE污染誘發(fā)先心病患兒的是孕期未接觸的3倍[4]。隨后的研究進(jìn)一步顯示：高齡孕婦孕期接觸TCE污染孕育先心病嬰兒的風(fēng)險率是孕期未接觸的6倍[5]。迄今為止，有關(guān)TCE與人先心病的研究主要局限在TCE污染地區(qū)的流行病學(xué)研究，而結(jié)果分析受多種因素的干擾，如污染地區(qū)其他污染物并存影響，暴露時間和強(qiáng)度的非可控性，樣本量數(shù)目的局限性等。鑒于我國每年新增先天性心臟病患者15～20萬以及TCE在我國的長期廣泛使用，因而有必要針對TCE心臟發(fā)育的毒性作用及其機(jī)制開展深入研究，從而提高人口生存質(zhì)量。TCE暴露與先心病之間是否具有因果關(guān)系，以及有關(guān)TCE在胚胎發(fā)育過程中對心肌毒性機(jī)制的研究罕有報道。本實驗室前期結(jié)果顯示，TCE可抑制人胚胎干細(xì)胞向心肌的定向分化[6]。

心臟分化發(fā)育是多個信號通路相互作用的結(jié)果。大量研究表明，Wnt信號通路調(diào)控心肌分化，并隨發(fā)育時程變化起到雙向調(diào)節(jié)的作用，在胚胎干細(xì)胞早期激活Wnt信號通路，可促進(jìn)中胚層發(fā)育和心肌細(xì)胞分化[7]。先天性心臟病全基因組數(shù)據(jù)顯示，Wnt通路的異常是散發(fā)性先天性心臟病的高風(fēng)險因素，經(jīng)典Wnt信號通路包括Wnt蛋白、Wnt受體、Dsh/Dvl蛋白、β-catenin、GSK-3β、TGF、APC蛋白等，該通路激活后可在以GSK-3β為主的調(diào)節(jié)作用下解聚β-catenin降解復(fù)合體，從而使低磷酸化β-catenin在胞質(zhì)中積累，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)后調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[8]。Wnt信號通路是否參與了TCE導(dǎo)致的心臟發(fā)育毒性尚不明確，本課題立足實驗室前期科研積累，以斑馬魚心臟胚胎發(fā)育為模型，探討Wnt信號通路在三氯乙烯心臟發(fā)育毒性中的作用，為尋找干預(yù)靶點提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

三氯乙烯TCE(CAS79-01-6，純度99%，購于Adamas-beta上?？偣?； CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈, CAS252917-06-9，純度>98%，購于Priceton公司)；XAV-939(3,5,7,8-四氫-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-D]嘧啶-4-酮CAS 284028-89-3，純度>98%，購于Selleck公司)；TRIzol購自天根生化有限公司；cDNA Synthesis MasterMix試劑盒購自BioMIGA公司；SYBR Select Master Mix, 購自TM Applied Biosystems公司。

1.2 斑馬魚胚胎培養(yǎng)

斑馬魚胚胎來自國家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)于系統(tǒng)養(yǎng)殖水中，恒溫28℃，每隔24 h更換養(yǎng)殖水，并分別加入相應(yīng)藥物，進(jìn)行如下分組：DMSO組、DMSO+CHIR、DMSO+XAV組、TCE處理組、TCE+CHIR組以及TCE+XAV組。其中 CHIR為Wnt信號通路激活劑，濃度為1 μmol/L；XAV為Wnt信號通路抑制劑，濃度為0.3 μmol/L；TCE的處理濃度為7.6 nmol/L(1 ppb)、76 nmol/L(10 ppb)、760 nmol/L(100 ppb)；TCE、CHIR和XAV均溶于DMSO中。經(jīng)過換算保證對照組和各處理組中DMSO濃度一致，均不超過5‰(前期的研究結(jié)果顯示，DMSO在此濃度不引發(fā)斑馬魚胚胎發(fā)育異常)[9]。

1.3 心臟發(fā)育形態(tài)觀察

取出已培養(yǎng)72 hpf(hours post-fertilization 受精后小時)的斑馬魚胚胎，恒溫體式鏡下記錄心臟發(fā)育情況，拍照，錄像評價血流循環(huán)，統(tǒng)計心臟畸形率和畸形類別。

1.4 斑馬魚心臟富集

注射器針頭剝離斑馬魚胚胎心臟，熒光顯微鏡下檢查心臟特異性綠色熒光蛋白，確認(rèn)心臟剖取完整性，用<10 μl的移液槍小心吸取剝離好的斑馬魚胚胎心臟置于放于冰上的1.5 ml離心管(預(yù)置350 μl裂解液)中，重復(fù)此項操作至該組全部斑馬魚胚胎心臟剝離完畢(實驗組和對照組分別60個斑馬魚胚胎，每次實驗重復(fù)3次)。

1.5 表達(dá)芯片及分析

提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA質(zhì)量，熒光素標(biāo)記后與安捷倫斑馬魚表達(dá)譜芯片雜交，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為變化幅度>2為上調(diào)基因，<-2即為下調(diào)基因。Go(gene ontology)分析統(tǒng)計靶基因個數(shù)，并進(jìn)行Pathway顯著性分析，集中分析與心臟發(fā)育相關(guān)的信號通路(該部分實驗由上海歐易有限公司協(xié)助完成)。

1.6 實時熒光定量PCR

TRIzol提取RNA后，用cDNA Synthesis MasterMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1. 以熒光定量PCR儀(ABI7500，購自Applied Biosystems 公司)檢測，以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt方法進(jìn)行差異分析(計算相對量)。

Tab.1Primer sequences for quantitative real-time PCR

GeneForwardReverseAxin2GGACACTTCAAGGAACAACTACCACTTTGCCGAGGATTTTGCCSox9bTGACGAGTTGTTCTCCAGAGAGGCCACACGTCTATAACCCNkx2.5GCTTTTACGCGAAGAACTTCCGATCTTCACCTGTGTGGAGGGapdhGACGCTGGTGCTGGTATTGCTCTACTCCTTGGAGGCCATGTGT

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三氯乙烯對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響

與對照組相比，斑馬魚胚胎在TCE暴露72 h出現(xiàn)顯著的心臟發(fā)育畸形(圖1)。TCE處理組的斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)心房心室比例異常、環(huán)化不全，心包腫大等嚴(yán)重畸形。與control組(畸形率：4.59%±0.65%)相比，TCE10 ppb組(畸形率：9.69%± 0.82%)，TCE100ppb組(畸形率：15.03%± 2.89%)斑馬魚胚胎心臟畸形表型比例顯著增加。此外高濃度劑量組，斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)卵黃囊出血、血液循環(huán)速度減慢以及心搏無力等更多畸形表型。

Fig.1Cardiac defects of zebrafish embryos exposed to TCE with different concentrations Arrows indicate heart malformations

2.2 三氯乙烯影響心臟組織特異性轉(zhuǎn)錄

剖取心臟組織，在熒光顯微鏡下確認(rèn)心臟剝離(圖2A)。提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，TCE處理導(dǎo)致1221基因表達(dá)上調(diào)，1531基因表達(dá)下調(diào)(圖2B)。進(jìn)行GO分析，顯示細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)事件的通路受到顯著影響，其中Wnt信號通路多個相關(guān)基因(NKX2.5, SOX9b及Axin2等)表達(dá)被下調(diào)(圖2C)。

Fig.2The mRNA array profiling analysis of TCE treatment on heart development

A: Dissection of heart tissue, GFP labeled heart under fluorescence microscope; B: mRNA profiling analysis; C: Target genes located in Wnt signaling pathway

2.3 三氯乙烯干擾Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)

結(jié)合基因表達(dá)芯片結(jié)果,進(jìn)一步檢測Wnt信號通路中的幾個相關(guān)靶基因表達(dá)水平。Q-PCR定量結(jié)果表明，N kx2.5, Sox9b及Axin2基因表達(dá)水平顯著降低，提示三氯乙烯抑制Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)(表2)。

GroupN kx2.5Axin2Sox9bControl1.02±0.060.99±0.021.02±0.051 ppb0.67±0.04?0.46±0.05?0.64±0.05??10 ppb0.37±0.09??0.43±0.06??0.25±0.08??100 ppb0.27±0.05??0.28±0.11??0.16±0.09??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4 Wnt信號通路在三氯乙烯心臟發(fā)育中的毒性作用

為進(jìn)一步驗證Wnt信號通路參與介導(dǎo)三氯乙烯致心臟發(fā)育中的毒性，我們在三氯乙烯10 ppb組加入Wnt信號通路激活劑CHIR(1 μmol/L)，檢測72 hpf后斑馬魚胚胎心臟發(fā)育情況。結(jié)果顯示，心包增大、心臟線性化、心搏無力等心臟畸形表型情況明顯改善(圖3)。但在DMSO+CHIR與DMSO組畸形率無顯著差異，說明CHIR本身對心臟發(fā)育無明顯影響。而Wnt信號通路抑制劑XAV(0.3 μmol/L)，本身即可顯著增加心臟畸形，與三氯乙烯聯(lián)合暴露更引起90%以上的胚胎心臟畸形(表3)。

Fig.3Wnt signaling pathway is involved in the cardiac developmental toxicity induced by TCE Arrows indicate heart malformations

Tab. 3 The effects of TCE on heart

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vscontrol +XAV

3 討論

先天性心臟病作為一種極為常見的先天畸形疾病，是由于胚胎發(fā)育時期胎體在遺傳及環(huán)境等多種因素單獨或者聯(lián)合作用下，引發(fā)心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常而導(dǎo)致胚胎心血管系統(tǒng)解剖功能出現(xiàn)異常。在體外細(xì)胞實驗中，本實驗室和其他研究組已有多個報道顯示，TCE孕期三氯乙烯暴露可顯著影響胚胎心臟發(fā)育，盡管相關(guān)信號通路尚不明確，但多數(shù)集中在心肌發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)受到干擾[10-11]。但細(xì)胞水平無法客觀反映整體動物代謝以及復(fù)合毒性的影響，如TCE可能的代謝中間物TCA的影響[12]?；诖?，本研究利用發(fā)育模式生物斑馬魚作為實驗對象，研究整體水平TCE的心臟發(fā)育毒性。斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，在研究生命科學(xué)的基礎(chǔ)問題，胚胎和組織器官發(fā)育的分子機(jī)制，以及建立毒理學(xué)模型等方面都得到廣泛的應(yīng)用[13]。特別值得注意的是斑馬魚早期胚胎不依賴母體血液循環(huán)，體外發(fā)育便于檢測，避免由于早期發(fā)育毒性所導(dǎo)致胚胎致死而錯過研究敏感時期。有研究證實，TCE濃度在10 ppb時即可引起斑馬魚胚胎血管網(wǎng)的減少和斑馬魚胚胎心臟F-肌動蛋白的分解失衡[14]。我們的研究結(jié)果顯示，TCE暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，主要表現(xiàn)在心臟環(huán)化不完全，心房心室體積比例異常，圍心腔腫大等畸形。在既往的多數(shù)TCE染毒實驗中，由于早期胚胎組織分離操作困難以及缺乏特異性高效的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)心臟發(fā)育毒性研究集中在整個胚胎的分析，這無法排除非心肌組織基因表達(dá)的干擾[15]。在本研究中采用心臟特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在熒光顯微鏡輔佐下，有效的富集心臟組織，這極大提高下游分析信號通路及基因表達(dá)的組織特異性，為后期相關(guān)的干擾治療提供精準(zhǔn)的參考信息。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在胚胎的心臟發(fā)育過程中至關(guān)重要，胚胎期由于環(huán)境暴露而改變Wnt信號通路可導(dǎo)致心臟畸形[16]。本研究發(fā)現(xiàn)TCE暴露導(dǎo)致的斑馬魚心臟畸形，在轉(zhuǎn)錄水平主要反映在影響細(xì)胞代謝以及形態(tài)重建，結(jié)合到觀察到形態(tài)畸形以及Wnt在細(xì)胞形態(tài)重建中的作用，該實驗著重研究Wnt信號通路變化。本研究結(jié)果表明，Wnt信號通路多個靶基因(N kx2.5, Sox9b, Axin2)受到抑制。N kx2.5在胚胎發(fā)育心臟祖細(xì)胞中高表達(dá)，而后在成年的心臟中維持較高水平，N kx2.5異常表達(dá)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加和心功能障礙[17]。N kx2.5的顯性突變在許多先天性心臟病中被報道，以房及室間隔缺損，法洛四聯(lián)癥為主要表型。N kx2.5參與心臟形成，在環(huán)化，心腔分化，間隔形成中起重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示N kx2.5顯著減低，這提示心肌祖細(xì)胞分化可能受到影響，這與之前我們在細(xì)胞水平的研究結(jié)果一致[6]。后期我們?nèi)孕鑼 kx2.5影響祖細(xì)胞分化的分子機(jī)制進(jìn)一步明確。

SOX和Axin2也都參與Wnt相關(guān)通路，經(jīng)典途徑中，GSK-3β通過Axin和APC結(jié)合形成的蛋白復(fù)合物磷酸化β-catenin而促使其經(jīng)蛋白酶體降解。Wnt信號存在激活Wnt-Fzd信號通路, GSK-3β受到抑制,使得胞內(nèi)游離β-catenin蛋白水平升高，繼而進(jìn)入核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[19]。CHIR為GSK-3的抑制劑，可以模仿經(jīng)典Wnt信號激活。在本研究中觀察到，加入CHIR可對心肌起到明顯的保護(hù)作用，能夠緩解TCE暴露下導(dǎo)致的心臟發(fā)育畸形，提示TCE暴露導(dǎo)致Wnt信號通路受抑制參與TCE介導(dǎo)心臟發(fā)育毒性的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步驗證，我們加入XAV939, XAV939是小分子選擇性抑制劑，通過穩(wěn)定Axin和APC復(fù)合物促進(jìn)β-catenin降解。本研究表明XAV本身即顯著增加斑馬魚胚胎心臟畸形，XAV與TCE聯(lián)合暴露更加劇了斑馬魚胚胎心臟畸形表型。

三氯乙烯通過抑制Wnt信號通路引起心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)改變，導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟畸形。本研究利用斑馬魚為模型，富集心臟，進(jìn)行組織特異性信號通路分析，為水環(huán)境污染物TCE介導(dǎo)心臟發(fā)育毒性提供了新的研究靶點。