史佳林， 夏 穎， 花 月， 張可佳， 陳 濤， 姜 巖△

(1. 蘇州大學醫(yī)學部， 江蘇 蘇州 215123； 2. 江蘇省老年疾病預防轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室， 蘇州大學， 江蘇 蘇州 215123)

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是一種易揮發(fā)的無色液體，作為清洗劑在電子、電鍍等行業(yè)長期廣泛應用，也常用作萃取溶劑和高分子化合物的生產(chǎn)原料等。由于其廣泛應用及其所具有的揮發(fā)性和微量溶水性，三氯乙烯已成為全球最重要的有機污染物之一，廣泛存在于大氣、土壤和地下水中[1]。對我國城市淺層地下水有機污染的研究也表明三氯乙烯是主要的污染物，2012年國際癌癥研究組織(International Agency for Research on Cancer, IARC)將三氯乙烯從2A類(人類可能致癌物)升級為I類(人類致癌物)[2]。

先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)是指胚胎期心血管發(fā)育異常而累及心功能的一組先天性畸形，新生兒的發(fā)病率為4.05%～12.3%，嚴重危害幼兒健康，越來越多的證據(jù)表明除遺傳因素外，環(huán)境因素是先心病發(fā)生的主要原因[3]。Goldberg等人首次報道，正常孕婦孕期接觸TCE污染誘發(fā)先心病患兒的是孕期未接觸的3倍[4]。隨后的研究進一步顯示：高齡孕婦孕期接觸TCE污染孕育先心病嬰兒的風險率是孕期未接觸的6倍[5]。迄今為止，有關TCE與人先心病的研究主要局限在TCE污染地區(qū)的流行病學研究，而結(jié)果分析受多種因素的干擾，如污染地區(qū)其他污染物并存影響，暴露時間和強度的非可控性，樣本量數(shù)目的局限性等。鑒于我國每年新增先天性心臟病患者15～20萬以及TCE在我國的長期廣泛使用，因而有必要針對TCE心臟發(fā)育的毒性作用及其機制開展深入研究，從而提高人口生存質(zhì)量。TCE暴露與先心病之間是否具有因果關系，以及有關TCE在胚胎發(fā)育過程中對心肌毒性機制的研究罕有報道。本實驗室前期結(jié)果顯示，TCE可抑制人胚胎干細胞向心肌的定向分化[6]。

心臟分化發(fā)育是多個信號通路相互作用的結(jié)果。大量研究表明，Wnt信號通路調(diào)控心肌分化，并隨發(fā)育時程變化起到雙向調(diào)節(jié)的作用，在胚胎干細胞早期激活Wnt信號通路，可促進中胚層發(fā)育和心肌細胞分化[7]。先天性心臟病全基因組數(shù)據(jù)顯示，Wnt通路的異常是散發(fā)性先天性心臟病的高風險因素，經(jīng)典Wnt信號通路包括Wnt蛋白、Wnt受體、Dsh/Dvl蛋白、β-catenin、GSK-3β、TGF、APC蛋白等，該通路激活后可在以GSK-3β為主的調(diào)節(jié)作用下解聚β-catenin降解復合體，從而使低磷酸化β-catenin在胞質(zhì)中積累，轉(zhuǎn)移入細胞核內(nèi)后調(diào)節(jié)靶基因表達[8]。Wnt信號通路是否參與了TCE導致的心臟發(fā)育毒性尚不明確，本課題立足實驗室前期科研積累，以斑馬魚心臟胚胎發(fā)育為模型，探討Wnt信號通路在三氯乙烯心臟發(fā)育毒性中的作用，為尋找干預靶點提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

三氯乙烯TCE(CAS79-01-6，純度99%，購于Adamas-beta上海總公司)； CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈, CAS252917-06-9，純度>98%，購于Priceton公司)；XAV-939(3,5,7,8-四氫-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-D]嘧啶-4-酮CAS 284028-89-3，純度>98%，購于Selleck公司)；TRIzol購自天根生化有限公司；cDNA Synthesis MasterMix試劑盒購自BioMIGA公司；SYBR Select Master Mix, 購自TM Applied Biosystems公司。

1.2 斑馬魚胚胎培養(yǎng)

斑馬魚胚胎來自國家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)于系統(tǒng)養(yǎng)殖水中，恒溫28℃，每隔24 h更換養(yǎng)殖水，并分別加入相應藥物，進行如下分組：DMSO組、DMSO+CHIR、DMSO+XAV組、TCE處理組、TCE+CHIR組以及TCE+XAV組。其中 CHIR為Wnt信號通路激活劑，濃度為1 μmol/L；XAV為Wnt信號通路抑制劑，濃度為0.3 μmol/L；TCE的處理濃度為7.6 nmol/L(1 ppb)、76 nmol/L(10 ppb)、760 nmol/L(100 ppb)；TCE、CHIR和XAV均溶于DMSO中。經(jīng)過換算保證對照組和各處理組中DMSO濃度一致，均不超過5‰(前期的研究結(jié)果顯示，DMSO在此濃度不引發(fā)斑馬魚胚胎發(fā)育異常)[9]。

1.3 心臟發(fā)育形態(tài)觀察

取出已培養(yǎng)72 hpf(hours post-fertilization 受精后小時)的斑馬魚胚胎，恒溫體式鏡下記錄心臟發(fā)育情況，拍照，錄像評價血流循環(huán)，統(tǒng)計心臟畸形率和畸形類別。

1.4 斑馬魚心臟富集

注射器針頭剝離斑馬魚胚胎心臟，熒光顯微鏡下檢查心臟特異性綠色熒光蛋白，確認心臟剖取完整性，用<10 μl的移液槍小心吸取剝離好的斑馬魚胚胎心臟置于放于冰上的1.5 ml離心管(預置350 μl裂解液)中，重復此項操作至該組全部斑馬魚胚胎心臟剝離完畢(實驗組和對照組分別60個斑馬魚胚胎，每次實驗重復3次)。

1.5 表達芯片及分析

提取細胞總RNA，檢測RNA質(zhì)量，熒光素標記后與安捷倫斑馬魚表達譜芯片雜交，并進行數(shù)據(jù)分析，差異基因篩選標準為變化幅度>2為上調(diào)基因，<-2即為下調(diào)基因。Go(gene ontology)分析統(tǒng)計靶基因個數(shù)，并進行Pathway顯著性分析，集中分析與心臟發(fā)育相關的信號通路(該部分實驗由上海歐易有限公司協(xié)助完成)。

1.6 實時熒光定量PCR

TRIzol提取RNA后，用cDNA Synthesis MasterMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增，引物見表1. 以熒光定量PCR儀(ABI7500，購自Applied Biosystems 公司)檢測，以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt方法進行差異分析(計算相對量)。

Tab.1Primer sequences for quantitative real-time PCR

GeneForwardReverseAxin2GGACACTTCAAGGAACAACTACCACTTTGCCGAGGATTTTGCCSox9bTGACGAGTTGTTCTCCAGAGAGGCCACACGTCTATAACCCNkx2.5GCTTTTACGCGAAGAACTTCCGATCTTCACCTGTGTGGAGGGapdhGACGCTGGTGCTGGTATTGCTCTACTCCTTGGAGGCCATGTGT

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 三氯乙烯對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響

與對照組相比，斑馬魚胚胎在TCE暴露72 h出現(xiàn)顯著的心臟發(fā)育畸形(圖1)。TCE處理組的斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)心房心室比例異常、環(huán)化不全，心包腫大等嚴重畸形。與control組(畸形率：4.59%±0.65%)相比，TCE10 ppb組(畸形率：9.69%± 0.82%)，TCE100ppb組(畸形率：15.03%± 2.89%)斑馬魚胚胎心臟畸形表型比例顯著增加。此外高濃度劑量組，斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)卵黃囊出血、血液循環(huán)速度減慢以及心搏無力等更多畸形表型。

Fig.1Cardiac defects of zebrafish embryos exposed to TCE with different concentrations Arrows indicate heart malformations

2.2 三氯乙烯影響心臟組織特異性轉(zhuǎn)錄

剖取心臟組織，在熒光顯微鏡下確認心臟剝離(圖2A)。提取RNA進行轉(zhuǎn)錄組分析，TCE處理導致1221基因表達上調(diào)，1531基因表達下調(diào)(圖2B)。進行GO分析，顯示細胞外基質(zhì)重塑相關事件的通路受到顯著影響，其中Wnt信號通路多個相關基因(NKX2.5, SOX9b及Axin2等)表達被下調(diào)(圖2C)。

Fig.2The mRNA array profiling analysis of TCE treatment on heart development

A: Dissection of heart tissue, GFP labeled heart under fluorescence microscope; B: mRNA profiling analysis; C: Target genes located in Wnt signaling pathway

2.3 三氯乙烯干擾Wnt信號通路相關基因表達

結(jié)合基因表達芯片結(jié)果,進一步檢測Wnt信號通路中的幾個相關靶基因表達水平。Q-PCR定量結(jié)果表明，N kx2.5, Sox9b及Axin2基因表達水平顯著降低，提示三氯乙烯抑制Wnt信號通路相關基因表達(表2)。

GroupN kx2.5Axin2Sox9bControl1.02±0.060.99±0.021.02±0.051 ppb0.67±0.04?0.46±0.05?0.64±0.05??10 ppb0.37±0.09??0.43±0.06??0.25±0.08??100 ppb0.27±0.05??0.28±0.11??0.16±0.09??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4 Wnt信號通路在三氯乙烯心臟發(fā)育中的毒性作用

為進一步驗證Wnt信號通路參與介導三氯乙烯致心臟發(fā)育中的毒性，我們在三氯乙烯10 ppb組加入Wnt信號通路激活劑CHIR(1 μmol/L)，檢測72 hpf后斑馬魚胚胎心臟發(fā)育情況。結(jié)果顯示，心包增大、心臟線性化、心搏無力等心臟畸形表型情況明顯改善(圖3)。但在DMSO+CHIR與DMSO組畸形率無顯著差異，說明CHIR本身對心臟發(fā)育無明顯影響。而Wnt信號通路抑制劑XAV(0.3 μmol/L)，本身即可顯著增加心臟畸形，與三氯乙烯聯(lián)合暴露更引起90%以上的胚胎心臟畸形(表3)。

Fig.3Wnt signaling pathway is involved in the cardiac developmental toxicity induced by TCE Arrows indicate heart malformations

Tab. 3 The effects of TCE on heart

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vscontrol +XAV

3 討論

先天性心臟病作為一種極為常見的先天畸形疾病，是由于胚胎發(fā)育時期胎體在遺傳及環(huán)境等多種因素單獨或者聯(lián)合作用下，引發(fā)心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常而導致胚胎心血管系統(tǒng)解剖功能出現(xiàn)異常。在體外細胞實驗中，本實驗室和其他研究組已有多個報道顯示，TCE孕期三氯乙烯暴露可顯著影響胚胎心臟發(fā)育，盡管相關信號通路尚不明確，但多數(shù)集中在心肌發(fā)育相關基因表達受到干擾[10-11]。但細胞水平無法客觀反映整體動物代謝以及復合毒性的影響，如TCE可能的代謝中間物TCA的影響[12]。基于此，本研究利用發(fā)育模式生物斑馬魚作為實驗對象，研究整體水平TCE的心臟發(fā)育毒性。斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，在研究生命科學的基礎問題，胚胎和組織器官發(fā)育的分子機制，以及建立毒理學模型等方面都得到廣泛的應用[13]。特別值得注意的是斑馬魚早期胚胎不依賴母體血液循環(huán)，體外發(fā)育便于檢測，避免由于早期發(fā)育毒性所導致胚胎致死而錯過研究敏感時期。有研究證實，TCE濃度在10 ppb時即可引起斑馬魚胚胎血管網(wǎng)的減少和斑馬魚胚胎心臟F-肌動蛋白的分解失衡[14]。我們的研究結(jié)果顯示，TCE暴露導致斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)嚴重畸形，主要表現(xiàn)在心臟環(huán)化不完全，心房心室體積比例異常，圍心腔腫大等畸形。在既往的多數(shù)TCE染毒實驗中，由于早期胚胎組織分離操作困難以及缺乏特異性高效的鑒別標準，多數(shù)心臟發(fā)育毒性研究集中在整個胚胎的分析，這無法排除非心肌組織基因表達的干擾[15]。在本研究中采用心臟特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在熒光顯微鏡輔佐下，有效的富集心臟組織，這極大提高下游分析信號通路及基因表達的組織特異性，為后期相關的干擾治療提供精準的參考信息。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在胚胎的心臟發(fā)育過程中至關重要，胚胎期由于環(huán)境暴露而改變Wnt信號通路可導致心臟畸形[16]。本研究發(fā)現(xiàn)TCE暴露導致的斑馬魚心臟畸形，在轉(zhuǎn)錄水平主要反映在影響細胞代謝以及形態(tài)重建，結(jié)合到觀察到形態(tài)畸形以及Wnt在細胞形態(tài)重建中的作用，該實驗著重研究Wnt信號通路變化。本研究結(jié)果表明，Wnt信號通路多個靶基因(N kx2.5, Sox9b, Axin2)受到抑制。N kx2.5在胚胎發(fā)育心臟祖細胞中高表達，而后在成年的心臟中維持較高水平，N kx2.5異常表達可導致心肌細胞凋亡數(shù)目增加和心功能障礙[17]。N kx2.5的顯性突變在許多先天性心臟病中被報道，以房及室間隔缺損，法洛四聯(lián)癥為主要表型。N kx2.5參與心臟形成，在環(huán)化，心腔分化，間隔形成中起重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示N kx2.5顯著減低，這提示心肌祖細胞分化可能受到影響，這與之前我們在細胞水平的研究結(jié)果一致[6]。后期我們?nèi)孕鑼 kx2.5影響祖細胞分化的分子機制進一步明確。

SOX和Axin2也都參與Wnt相關通路，經(jīng)典途徑中，GSK-3β通過Axin和APC結(jié)合形成的蛋白復合物磷酸化β-catenin而促使其經(jīng)蛋白酶體降解。Wnt信號存在激活Wnt-Fzd信號通路, GSK-3β受到抑制,使得胞內(nèi)游離β-catenin蛋白水平升高，繼而進入核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子表達[19]。CHIR為GSK-3的抑制劑，可以模仿經(jīng)典Wnt信號激活。在本研究中觀察到，加入CHIR可對心肌起到明顯的保護作用，能夠緩解TCE暴露下導致的心臟發(fā)育畸形，提示TCE暴露導致Wnt信號通路受抑制參與TCE介導心臟發(fā)育毒性的產(chǎn)生。為了進一步驗證，我們加入XAV939, XAV939是小分子選擇性抑制劑，通過穩(wěn)定Axin和APC復合物促進β-catenin降解。本研究表明XAV本身即顯著增加斑馬魚胚胎心臟畸形，XAV與TCE聯(lián)合暴露更加劇了斑馬魚胚胎心臟畸形表型。

三氯乙烯通過抑制Wnt信號通路引起心臟發(fā)育相關基因表達改變，導致斑馬魚胚胎心臟畸形。本研究利用斑馬魚為模型，富集心臟，進行組織特異性信號通路分析，為水環(huán)境污染物TCE介導心臟發(fā)育毒性提供了新的研究靶點。