李 想，巫楊捷，張 健，張夢露，成 碩，馬蘭青，薛飛燕

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京 102206)

中國花生種植范圍廣其年總產(chǎn)達(dá)1 500萬 t，居世界第一位[1-2]?；ㄉ谏L發(fā)育過程中，施用微生物肥料可以改善土壤肥力，提高花生產(chǎn)量[3-4]。

微生物菌劑種類繁多、功能多樣，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大[5-6]。微生物菌劑進(jìn)入土壤后與土壤的微生物相互作用，不僅促進(jìn)農(nóng)作物生長，也能對土壤微生物群落產(chǎn)生有益影響[7-8]，如補(bǔ)充土壤有益微生物[9]、增強(qiáng)植物營養(yǎng)元素吸收[10]、減少土壤有害殘余物質(zhì)[11]。

粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)作為一種用于生物防治的拮抗菌，具有拮抗效果好且不產(chǎn)生毒素的特點(diǎn)[12]。課題組前期工作也表明粘紅酵母對大豆[13]、蓖麻[14]和油菜[15]等植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用，并開展了粘紅酵母菌劑作用機(jī)理的探索工作。本研究通過Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法，分析土壤細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4區(qū)域，探究施用粘紅酵母菌劑對花生種植及土壤細(xì)菌群落的影響，為揭示其作用機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

粘紅酵母菌種由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，供施要求YPD培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)至菌體濃度OD600約為0.6。花生種子購買于昌平種子站。

1.2 方 法

1.2.1 花生種植及菌劑施用試驗(yàn)方法 試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在北京農(nóng)學(xué)院大學(xué)科技園試驗(yàn)田。花生種植面積為67 m2，種植試驗(yàn)采取模塊交叉排列設(shè)計(jì)如圖1，每個(gè)模塊播種花生36穴，每穴播種經(jīng)溫水浸泡過夜預(yù)處理的花生種子1粒。菌劑試驗(yàn)組(MF)在每穴播種后滴加2 mL粘紅酵母菌液，空白對照組(CK)滴加2 mL水?；ㄉN子播種21 d后統(tǒng)計(jì)出苗率和測量幼苗株高?；ㄉN子播種4個(gè)月后采收花生果實(shí)并采集土壤樣品。

圖1 花生種植及菌劑施用設(shè)計(jì)圖Fig.1 Peanut planting and R. glutinis application design

1.2.2 花生農(nóng)藝性狀測量 測量幼苗株高、植株濕重、果實(shí)干重及出苗數(shù)，通過測量的數(shù)據(jù)計(jì)算出苗率和產(chǎn)量。

1.2.3 土壤細(xì)菌群落分析方法 1) 樣品采集：花生收獲時(shí)采集土樣，采集時(shí)每個(gè)模塊任選一株花生先去除地表面覆蓋物和1～2 cm表土，再采集0～20 cm耕層土，按照MF和CK分別混合，置于4 ℃冰盒保存。2)預(yù)處理：稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL的70%乙醇，震蕩混勻，10 000 r/m室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，10 000 r/m室溫離心3 min，棄置上層液體。將2 mL離心管倒置于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min。3)總DNA提?。簠⒄誒MEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書提取土壤樣品DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。4)PCR擴(kuò)增：以樣品總DNA為模板，設(shè)計(jì)上下游引物341F-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCT ACGGGNGGCWGCAG和805R-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHV GGGTATCTAATCC進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4區(qū)，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。5) DNA純化回收：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理，利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量和均一化。6)上機(jī)測序及數(shù)據(jù)分析：委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，測序平臺(tái)為 Miseq 2×300 bp，測序數(shù)據(jù)平均2萬條；所得數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控分析后，通過韋恩圖呈現(xiàn)樣本OUT(operational taxonomic unit)共有和獨(dú)有情況；通過PCA圖呈現(xiàn)樣本屬水平上物種結(jié)構(gòu)及豐度；通過與KEGG數(shù)據(jù)庫對比，比較功能基因豐度差異；所用16S細(xì)菌古菌核糖體數(shù)據(jù)庫包括RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)、Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)和NCBI 16S數(shù)據(jù)庫(http://ncbi.nlm.nih.gov/)，所用FGR功能基因數(shù)據(jù)庫為RDP整理來源于GenBank(http://fungene.cme.msu.edu/)。

采用SPSS 17.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘紅酵母菌劑對花生種植農(nóng)藝性狀的影響

如圖2所示，花生出苗率均在90%以上，施用菌劑可使花生種子出苗率顯著提高2.7%(0.05>P>0.01)(圖2-A)；主莖高度在一定程度上可以反映花生植株個(gè)體生育狀況，施用菌劑對花生幼苗株高未達(dá)到顯著影響(P>0.05)(圖2-B)；施用菌劑對花生植株質(zhì)量積累無顯著影響(P>0.05)，但對照組相比采收時(shí)每株花生全株濕重可提高30%以上(圖2-C)；施用菌劑每株花生的果實(shí)干重達(dá)41 g，與對照組相比顯著提高了28%(0.05>P>0.01)(圖2-D)，花生產(chǎn)量顯著提高；采收時(shí)對照組的植株枝葉更加繁茂，而菌肥處理組的果實(shí)更加豐碩(圖2-E)。

A為種子出苗率，B為幼苗株高，C為植株濕重，D為果實(shí)干重，E為采收時(shí)的植株與果實(shí)；CK為空白對照組，MF為菌劑試驗(yàn)組；*表示存在顯著性差異(0.05>P>0.01)Note: A is the seedling emergence rate. B is the plant height. C is the fresh weight of the whole plant. D is the fruit dry weight. E is the plant and peanut fruit at harvest. CK is a blank control group, while MF is R. glutinis application group. “*” indicates a significant difference (0.05>P>0.01)圖2 粘紅酵母菌劑對花生農(nóng)藝性狀的影響Fig.2 Effect of Rhodotorula glutinis on agronomic traits of peanut

2.2 粘紅酵母菌劑對花生土壤細(xì)菌群落的影響

MF和CK土壤基因組DNA提取結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3-A，完整性均良好。以土壤基因組為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得片段長度(包括引物等)如圖3-B，條帶單一濃度較高。

A為土壤樣品總DNA檢測結(jié)果，B為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果；CK為空白對照組，MF為菌劑試驗(yàn)組，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA MarkerNote: A is the total DNA ofsoil samples, while B is the PCR amplification products. CK is a blank control group, while MF is R. glutinis application group. M is the standard molecular weight DNA Marker圖3 瓊脂糖凝膠檢測DNA結(jié)果Fig.3 Results of the DNA analysis

MF和CK樣品經(jīng)Illumina MiSeq高通量測序的原始數(shù)據(jù)通過拼接過濾后獲得優(yōu)質(zhì)序列分別為55 992條和48 328條，并進(jìn)行OTU分析、細(xì)菌群落組成、代謝功能預(yù)測及差異比較，如圖4-6。

注： 所用數(shù)據(jù)為經(jīng)過質(zhì)控后的優(yōu)質(zhì)序列，序列相似性高于97%定義為一個(gè)OUTNote: The qualified sequence with the similarity higher than 97% was defined as an OTU圖4 OTU分析Venn圖Fig.4 Venn diagram of OTU analysis

注： CK為空白對照組，MF為菌劑試驗(yàn)組；滿足相似度大于90%且覆蓋率大于90%的序列進(jìn)行分類，不滿足條件的序列歸為unclssified；顏色對應(yīng)不同物種名稱，不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例，為了展示效果，只顯示豐度最高的前50個(gè)物種分類信息，豐度低的物種分類合并成Note:CK is a blank control group, while MF is R. glutinis application group. Sequences with both similarity and coverage rate higher than 90% were classified, otherwise were treated as unclssified. Different colors indicated different species names and different width of the corresponding colors indicates the relative abundance. Only the top 50 species with the high abundance were showed while the rest with low abundance were bracketed as other圖5 屬水平細(xì)菌群落組成Fig.5 Genus-level taxonomic composition of the bacterial community

注： CK為空白對照組，MF為菌劑試驗(yàn)組；圖左邊為不同功能豐度在兩個(gè)樣品組的豐度比例，中間為95%置信度區(qū)間內(nèi)功能豐度差異比例，右邊為P值，P值<0.05，表示差異顯著Note:CK is a blank control group, while MF is R. glutinis application group. The left side of the figure shows the abundance ratio of the different functional abundances in the two sample groups. The middle is the functional abundance difference ratio in the 95% confidence inter. The right side is the p value. P<0.05 indicating significant difference圖6 細(xì)菌群落代謝功能預(yù)測及差異比較結(jié)果Fig.6 Bacterial community metabolic function prediction and comparison of differences

所有樣本優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，并統(tǒng)計(jì)分析97%相似水平的OTU。如圖4，施肥試驗(yàn)組土壤中共有6 594個(gè)OTUs，對照組土壤共有6 011個(gè)OTUs，即施肥組土壤樣品的細(xì)菌種類多于空白對照組。施肥試驗(yàn)組和空白對照組共有OTUs為2 817個(gè)，占比(分別42.7%和46.9%)均不足50%，表明施用粘紅酵母菌劑對花生土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化影響較大。

為了得到每個(gè)OUT對應(yīng)的物種分類信息，利用blastn將OUT序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得比對結(jié)果，對比滿足相似度大于90%且覆蓋率大于90%的序列進(jìn)行分類，不滿足條件的序列歸為unclssified。

如圖5屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布結(jié)果表明，已經(jīng)明確分類且相對豐度前4位的菌屬為Gp6、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)，占檢測總菌屬大于20%。菌劑施用MF組和空白對照CK組在細(xì)菌群落組成上有差異， MF組較CK組在氣單胞菌屬(Aeromonas) 、溶桿菌屬(Lysobacter)和藤黃單胞菌(Luteimonas)的豐度方面顯著增加；微小桿菌屬(Exiguobacterium) 、檸檬酸細(xì)菌屬(citrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)明顯增加；Gp6、Subdivision3_genera_incertae_sedis和Gp4明顯減少。

基于16S rDNA序列預(yù)測土壤細(xì)菌群落KEGG Pathway的功能基因，比較MF和CK樣品細(xì)菌群落代謝功能預(yù)測及差異如圖6，結(jié)果表明兩組樣品p值最低的25個(gè)功能豐度差異極顯著，豐度差異比例較大的是離子耦合轉(zhuǎn)運(yùn)體(other ion-coulped transporters)、細(xì)胞膜及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分子(Membrane and intracellular structural molecules)和DNA修復(fù)及重組蛋白功能(DNA repair and recombination proteins)。離子轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的缺失、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、DNA修復(fù)等將會(huì)影響植物生長發(fā)育、生理代謝、吸收土壤養(yǎng)分能力、抗逆能力以及對各種遺傳變異的應(yīng)答能力等[16-17]。

3 討論與結(jié)論

施用微生物菌肥可以改善土壤理化狀況，增強(qiáng)土地肥力，促進(jìn)花生對養(yǎng)分的吸收，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[18]。馬文彬等[19]通過施用植物促生菌，對甘草的生長有明顯的促進(jìn)作用。趙柏霞等[20]證明生物菌劑可以促進(jìn)根系的生長和植株干重的增加。本試驗(yàn)通過添加粘紅酵母菌劑，證明粘紅酵母對花生的種子出苗率、株高、植株濕重、果實(shí)干重及產(chǎn)量均產(chǎn)生了促進(jìn)作用，植株濕重包括植株質(zhì)量和果實(shí)質(zhì)量，濕重雖然沒有顯著提高，但是對花生出芽率、果實(shí)干重和產(chǎn)量的影響較為明顯，說明粘紅酵母菌劑對花生生長和產(chǎn)量存在促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)采用的Illumina Miseq高通量測序技術(shù)是目前應(yīng)用最普遍的技術(shù)，與傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、Biolog微平板法和磷脂脂肪酸(PLFA)法[21]相比，具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本等特點(diǎn)[22]。微生物群落的豐度與多樣性可以維持土壤的健康與質(zhì)量，多樣性減少可能會(huì)造成土壤的病害頻發(fā)[23]。有機(jī)肥進(jìn)入土壤后會(huì)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響，土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)的降解和土壤養(yǎng)分(C、N、P、S)的循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[24]。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響土壤微生物功能特性的改變[25]。本試驗(yàn)共得到55 992條優(yōu)質(zhì)序列，6 594個(gè)OTUs，較對照組相比，細(xì)菌種類更加豐富。其中芽單胞菌屬(Gemmatimonas)出現(xiàn)在有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤中[26]。假單胞菌屬(Pseudomonas)可以根據(jù)自身需要同化土壤中的磷[27]。微小桿菌屬(Exiguobacterium)作為氨化菌，可以使土壤中的有機(jī)氮降解并提高肥力[28]。芮文鴻等[29]證明Gp6、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)與土壤有機(jī)質(zhì)之間存在一定關(guān)聯(lián)，并對土壤養(yǎng)分有一定影響和調(diào)控。

本研究通過傳統(tǒng)的花生種植方式，在栽培過程中添加粘紅酵母菌劑。結(jié)果表明粘紅酵母菌劑不僅對花生的農(nóng)藝性狀有促進(jìn)作用，也可以增加種植土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。