韓遠芳，趙帥琪，李伊然，谷 思，邢 宇

(北京農(nóng)學院 植物科學技術(shù)學院，農(nóng)業(yè)應用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京林果業(yè)生態(tài)功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

存在于高等植物中的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因其氨基酸序列中含有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名。WRKY蛋白根據(jù)序列中WRKY域的數(shù)量以及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三組(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。WRKY蛋白另一個典型的特征是通過與其靶基因啟動子中的W-box [TGACC(A / T)]結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達[1]。

植物生長在外界壞境中會受到各種各樣的侵害，當植物機體受到機械損傷、病原物侵害、生物脅迫以及非生物脅迫時，WRKY基因都可以快速而大量的表達[2]。目前，越來越多的WRKY基因都被證明與植物抗病有關(guān)，例如，OsWRKY22不僅能夠正向調(diào)控稻瘟病，還能與ART1互作共同調(diào)控增強水稻的耐鋁性[3]；將辣椒中的CaWRKY27在煙草中過表達后發(fā)現(xiàn)增強了其對青枯病的抗性[4]。

草莓(Fragaria×ananassa)薔薇科草莓屬的多年生草本植物[5]，因其香甜可口顏色艷麗又富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，而深受人們喜愛，到目前為止，我國草莓的種植面積和產(chǎn)量都處于世界領(lǐng)先地位，但是在草莓生產(chǎn)中，長年連續(xù)栽種使草莓重茬病害頻發(fā)，導致產(chǎn)量下降品質(zhì)降低。

草莓的倍性豐富，栽培草莓多以八倍體為主供人們食用，而二倍體草莓多為野生草莓，具有遺傳背景簡單，基因組小，生命周期短等特點，進而成為研究草莓基因功能的理想模式植物。本文以森林草莓‘Hawaii 4’作為試驗材料，通過基因克隆、生物信息學分析及實時熒光定量分析等手段，以期闡明FvWRKY22在草莓抗重茬中的作用，對草莓抗重茬病的改良具有十分重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

主要以培養(yǎng)在人工氣候室的二倍體森林草莓‘Hawaii 4’(Fragariavesca, ‘Hawaii 4’)以及‘Hawaii 4’組培苗為材料。

黃亞麗等[6]選取8個草莓連作區(qū)選取的草莓病株中分離出3種主要致病菌: 尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahlia)。選取保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的尖孢鐮刀菌(由北京農(nóng)學院生物科學與工程學院張國慶老師提供)和立枯絲核菌(由北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院趙曉燕老師提供)進行活化，25 ℃培養(yǎng)，形成新鮮的菌絲后，接種于P20培養(yǎng)基中，培養(yǎng)三天后將草莓幼苗接種于接過菌的培養(yǎng)基中，使菌絲與草莓根部接觸，在侵染后的0、1、3、6、12、24 h、3 d、5 d、7 d分別采集草莓根部組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1FvWRKY22的克隆 森林草莓‘Hawaii 4’組織的總RNA由購于美國OMEGA公司的Plant RNA Kit提取，方法詳見試劑盒說明書，經(jīng)過DNA純化后，以Prime ScriptTMDouble Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以擬南芥AtWRKY22蛋白保守序列為電子探針，在草莓基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，找到1個同源性很高的基因，命名為FvWRKY22。根據(jù)該基因的CDS序列，使用Primer軟件設計引物，正向引物序列為：5’-ATGGAAGACGATTGGGATCTC-3’, 反向引物序列為：5’-TCAGATACTACTGGCGGC-3’，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。以森林草莓cDNA為模板進行PCR。

檢測后采用Axygen公司的膠回收試劑盒回收目的片段，方法詳見說明書，將回收產(chǎn)物與pGEM?-T Easy (Promega)載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α中，涂板后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，進行藍白斑篩選。菌落PCR驗證呈陽性后送于北京六合華大科技有限公司進行測序。

1.2.2FvWRKY22生物信息學分析 利用ExPaSy對FvWRKY22基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析及蛋白質(zhì)的親/疏水性分析；利用GOR4進行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析；利用NLS mapper進行核定位信號分析；利用DNAMAN、ClustalX進行序列比對；利用MEGA X構(gòu)建進化樹。

1.2.3 實時熒光定量PCR 用于qRT-PCR的引物使用Beacon Designer 7.9軟件進行設計，正向引物序列為5’-CTTCTCTGTTCTTCCTATTGTT-3’,反向引物序列為5’-TTGTGGAGTTGTTGATGG-3’, 引物經(jīng)過檢測符合要求后用于試驗，內(nèi)參基因為FvActin。采用SYBR?Premix TaqTMMix試劑盒，反應體系為cDNA模板2 μL，前后引物各0.25 μL，SYBR Green Ⅱ 5μL，加入ddH2O補至10 μL，反應程序為： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 20s，72 ℃ 20 s，39個循環(huán)。設3次平行重復，利用Light Cycler?96 SW1.1 Real-Time PCR System進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FvWRKY22基因的克隆

以森林草莓各組織cDNA為模板對森林草莓FvWRKY22基因的全長進行克隆。PCR產(chǎn)物電泳檢測如圖1所示，將大小正確的目的條帶進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、涂板、菌落PCR和測序之后，用 DNAMAN 5.2.2軟件進行序列拼接和比對，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與基因組序列信息完全吻合，確認成功克隆到FvWRKY22，將得到的菌液進行保菌于-80 ℃冰箱中保存，提取的質(zhì)粒于-20 ℃保存。

2.2 FvWRKY22基因的序列分析

通過DNAMAN軟件對FvWRKY22進行分析，F(xiàn)vWRKY22開放閱讀框為1038bp，編碼345個氨基酸，在位于第169～225氨基酸之間含有一個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族Ⅱ類e亞族，其鋅指結(jié)構(gòu)為C-X5-C-X23-H-X-H。利用生物信息學網(wǎng)站解析FvWRKY22蛋白的理化性質(zhì)，其結(jié)果表明，F(xiàn)vWRKY22基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為37.72 kD，理論等電點為8.5，為疏水蛋白，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，α螺旋和β螺旋所占比例分別為16.81 %和18.26 %，無規(guī)則卷曲作為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成元件所占的比例較高，為64.93 %，利用NLS mapper分析該基因核定位信號序列為QRSKKRKNL (圖2)。

M: DL2000; 1-4均為FvWRKY22擴增產(chǎn)物圖1 FvWRKY22基因擴增M: DL2000; 1-4 are FvWRKY22 PCR productsFig.1 The PCR product in FvWRKY22 genes

通過blast比對，選取Ident數(shù)較高的序列(RcWRKY22: >PRQ58289.1;PpWRKY22: >XP_007218198.1;PaWRKY22: >XP_021807936.1;PpWRKY14: >AOT85447.1;MdWRKY22-like: >XP_008347124.1;ZjWRKY68: >AYD59726.1;TcWRKY22: >XP_007051705.2;CcWRKY22: >XP_006444950.1;HbWRKY22-like: >XP_021644094.1;ZjWRKY59: >AYD59718.1;AtWRKY22: >NP_192034.1)，利用Mega X軟件比較FvWRKY22與上述基因進化關(guān)系，結(jié)果如圖3發(fā)現(xiàn)在進化上與FvWRKY22關(guān)系最近的是月季RcWRKY22(登錄號: >PRQ58289.1)。運用ClustalX軟件對森林草莓FvWRKY22的氨基酸序列與上述基因的氨基酸的進行同源性比較，結(jié)果如圖4發(fā)現(xiàn)所比較的所有基因的氨基酸序列都集中在1個WRKY保守域中。

黃色高亮處為WRKY域，紅框處為鋅指結(jié)構(gòu)，黑線處為核定位信號圖2 森林草莓FvWRKY22的CDS區(qū)及其編碼的氨基酸 The yellow-highlight part represents WRKY domain. The red box represents a Zinc finger,andthe underlined part is a nuclear location signal Fig.2 The CDS sequence and amino acid of FvWRKY22

圖3 根據(jù)氨基酸序列聚類的植物WRKY22基因進化關(guān)系分析Fig.3 Phylogenetic relationship based on amino acid sequence among plant WRKY22

2.3 FvWRKY22基因的表達分析

將FvWRKY22在森林草莓‘Hawaii 4’的不同組織部位進行基因表達量分析，如圖5，F(xiàn)vWRKY22在根、莖、葉中均有表達，在果實中表達量相對較低，幾乎沒有表達。由圖6可以看出，在經(jīng)過立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌誘導后，F(xiàn)vWRKY22的表達量均呈現(xiàn)相同的趨勢，即先增加后降低再增加再降低，在處理后1 h表達量達到最大，分別是處理前的2.16倍和5.22倍，因此，推測FvWRKY22基因可能參與了草莓重茬病的免疫反應。

黑線處為WRKY保守域，方框所標出的序列為核定位信號圖4 不同植物中WRKY22同源基因的序列比對The thick underline indicates the domain of WRKY, box indicates nuclear localization signal sequenceFig.4 Alignment of plant WRKY22 gene homologous sequences based on amino acid sequence clustering

圖5 FvWRKY22基因的表達分析Fig.5 Expression Analysis of FvWRKY22

圖6 FvWRKY22基因在重茬病菌侵染后的相對表達量Fig.6 The relative expression of FvWRKY22 gene after the treatment of replant disease

3 討 論

WRKY家族是高等植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，對植物生長發(fā)育的各個階段都有重要的調(diào)控作用。本研究以森林草莓‘Hawaii 4’為研究材料，基因利用qRT-PCR技術(shù)分析經(jīng)過重茬病菌立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的誘導后FvWRKY22的表達模式。有研究表明，OsWRKY6在白葉枯病菌侵染水稻幼苗后表達量持續(xù)增加[7]；GhWRKY15經(jīng)過枯萎病菌誘導后表達量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢[8]，結(jié)合本研究，森林草莓在經(jīng)過重茬病菌侵染之后，F(xiàn)vWRKY22的表達呈現(xiàn)先增加后降低再增加再降低的表達趨勢，且在侵染1 h后表達量最高，與上述研究結(jié)果有一定差異，一方面可能與取樣時間存在差異有關(guān)。另一方面可能是當病原菌侵染植物時，不同植物做出的反應機制不同，許多植物表現(xiàn)出抗病和感病的差別主要是由病原菌侵染植物時抗性反應的時序性導致的，病原菌侵染植物后抗、感株系均會有防御反應發(fā)生，只是抗病株系的防御反應速度較快且強烈，而感病植株對病菌的防御反應比較遲緩且信號較弱，以至于防御反應對病原菌的侵染沒有抵抗作用[9]。因此推測，當立枯絲核菌侵染森林草莓植株時，F(xiàn)vWRKY22的表達量在1 h達到最高，說明植株對于病菌產(chǎn)生防御反應，但當病原菌持續(xù)侵染時，植株感病，表達量降低，隨著侵染時間的增加，感病植株再次產(chǎn)生防御反應，表達量再次增加，但對病菌沒有抵抗作用，植株死亡。另一種病原菌尖孢鐮刀菌對森林草莓侵染后，F(xiàn)vWRKY22也表現(xiàn)出相似的表達趨勢。通過對FvWRKY22的克隆及表達分析，推測轉(zhuǎn)錄因子FvWRKY22可能與草莓重茬病的抗性有關(guān)，為提升草莓品質(zhì)和品種改良提供了理論支持。