田 鳳，常震宇，丁 進(jìn)，李成忠，馮 妍，封紫嫣，倪和民，盛熙暉，齊曉龍，邢 凱，郭 勇，王相國(guó)*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 北京雄特牧業(yè)有限公司，北京 100101；3.昌平區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理局十三陵防疫站，北京 102200)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛圍產(chǎn)期后由于多種細(xì)菌感染子宮內(nèi)膜引發(fā)的一種嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的疾病[1-2]。炎癥的嚴(yán)重程度、子宮內(nèi)膜損傷后恢復(fù)時(shí)間、子宮內(nèi)膜腺體的損傷及輸卵管環(huán)境改變嚴(yán)重影響了奶牛的繁殖活動(dòng)[3]，其導(dǎo)致的奶牛屢配不孕，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。根據(jù)奶牛子宮內(nèi)膜炎的癥狀分為卡他性、黏液性、纖維蛋白性、膿性子宮內(nèi)膜炎和隱性子宮內(nèi)膜炎[1-2]。目前，根據(jù)臨床癥狀和分泌物的分析來(lái)判斷子宮內(nèi)膜炎的方法，不僅發(fā)現(xiàn)早期病變的速度慢，而且影響奶牛子宮內(nèi)膜炎的早期治療。因此，對(duì)子宮內(nèi)膜炎疾病的早期診斷就顯得尤為重要。

外泌體及其內(nèi)含的小RNA，在不同疾病的進(jìn)展中扮演者重要的角色。Taylor等[6]通過(guò)外泌體中小RNA的表達(dá)譜研究證實(shí)其差異表達(dá)可為卵巢癌疾病的預(yù)測(cè)提供依據(jù)。Cazzoli等[7]發(fā)現(xiàn)肺腺癌、肺肉芽腫患者外泌體內(nèi)miR-378可以作為肺癌的生物標(biāo)志物。Skog等[8]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)外泌體內(nèi)小RNA同樣有差異表達(dá)。另有研究表明，外泌體及其小RNA還可作為疾病的一種治療方法[9]。然而，外泌體及其小RNA在奶牛子宮內(nèi)膜炎診斷中的診斷與應(yīng)用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)采用透射電鏡、蛋白免疫等分子手段對(duì)健康和患病奶牛子宮腔液中外泌體進(jìn)行驗(yàn)證，并通過(guò)基因組測(cè)序?qū)ν饷隗w中的小RNA的長(zhǎng)度、分布比例及組成進(jìn)行分析。對(duì)健康和患病奶牛小RNA的比較分析，為子宮內(nèi)膜炎的預(yù)測(cè)及診斷方法提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

健康牛子宮和患有炎癥的牛子宮各6個(gè)。4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗子宮，收集腔液于離心管中，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于-80 ℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 儀器與試劑 外泌體提取試劑盒購(gòu)自貝博公司；無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇購(gòu)自北京化工廠；Trizol Reagent RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen USA LTD；RNA ScreenTape 樣品緩沖液購(gòu)自安捷倫科技(中國(guó))有限公司；透射電子顯微鏡；微量紫外分光檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Alphaspec Innotech；移液器購(gòu)自Gilson；Agilent 4200 TapeStation購(gòu)自安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2.2 子宮腔液中外泌體的提取 采用貝博總外泌體提取試劑盒(Exo-IsoIation)從子宮腔液中提取外泌體，步驟如下：

首先收集4 mL待提取的子宮腔液樣品，置于2～8 ℃保存。再將樣品在4 ℃條件下，3 000 r/min離心15 min。棄沉淀后，收集上清。小心將上清液移入另一干凈離心管中。將樣品在4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min后，棄沉淀，收集上清。小心將上清液移入另一干凈離心管中，在4 mL上清中加入1 mL提取液A，蓋緊離心管蓋，上下顛倒混勻1 min左右，使液體充分混勻。置于2～8 ℃冰箱靜置過(guò)夜。(注：靜置保存時(shí)間不少于10 h)在4 ℃條件下，10 000 r/min離心60 min。小心移除上清，收集沉淀。(盡可能吸干上清，吸取時(shí)，防止吸掉沉淀)取50～100 μL外泌體保存液將沉淀重懸，即得到外泌體樣品。最后將外泌體樣品保存于-80 ℃的冰箱中。

1.2.3 透射電子顯微鏡使用負(fù)染法對(duì)外泌體進(jìn)行形態(tài)觀察 首先選擇干凈的載玻片用Parafilm膜平整的粘在表面，其次將樣品用100 μL的4 ℃PBS溶解混勻后，吸取40 μL樣品滴于Parafilm膜上，形成一個(gè)均勻的液滴。用鑷子將帶有Formvar支持膜的銅網(wǎng)覆蓋在樣品滴上，使其漂浮3～5 min，根據(jù)樣品可調(diào)整時(shí)間長(zhǎng)短。用濾紙?jiān)谝旱芜吘墝悠芬何ズ?，吸?0 μL的3%的磷酸鎢染液滴于Parafilm膜上，1～2 min用濾紙將染液吸去。將染好的銅網(wǎng)放置在干凈、劃好分格線的平皿中干燥50 min后備用，透射電子顯微鏡觀察。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9表達(dá) 首先用 50 μL裂解液裂解貝博試劑盒提取的1 mL子宮腔液中的外泌體，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30 mA恒流電泳2 h。然后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。其次用5%脫脂奶粉的含吐溫20的PBS封閉液置于搖床，室溫孵育1 h以上。加入CD9一抗(1∶1000稀釋)，4 ℃過(guò)夜。次日，PBST洗膜(10 min，3次)后加入相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)2 h。加入化學(xué)發(fā)光底物顯色觀察，使用照膠儀拍照。

1.2.5 子宮腔液外泌體總RNA提取 外泌體中總RNA提取步驟如下(試劑耗材需要提前高壓滅菌，高溫烘箱烘干，所有離心均是：4 ℃離心(12 000 r/min)10 min)：

首先將-80 ℃中保存的子宮腔液中提取的外泌體，常溫溶解后，用1 mL的Trizol勻漿。冰盒放置5 min后，加入0.2 mL的氯仿，震蕩，4 ℃放置2～3 min，離心。取出已經(jīng)分層的懸浮液，吸取400 μL上層水相后轉(zhuǎn)移至新管中，加入完成預(yù)冷的500 μL的異丙醇，冰上靜置10 min，離心。吸出混合液，加入1 mL完成預(yù)冷的乙醇(75%)隨后彈擊EP管壁，使沉淀彈起。離心，棄乙醇。再次吸出混合液，加入1 mL完成預(yù)冷的乙醇(75%)隨后彈擊EP管壁，使沉淀彈起，離心。最后將上清液倒去，敞口在室溫條件下通風(fēng)干燥3～5 min，并加入20 μL RNA-free water，震蕩混勻。

1.2.6 RNA測(cè)序 由上海歐易生物有限公司檢測(cè)其樣本。取Trizol裂解抽提的總RNA樣品，經(jīng)紫外分光光度計(jì)以及Agilent 生物分析儀檢測(cè)其RNA濃度、純度、以及完整性，符合測(cè)序質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)后，制備cDNA文庫(kù)。將cDNA文庫(kù)用Illumin HiSeqTM2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，得到原始序列數(shù)據(jù)。最后測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。

1.2.7 Small RNA測(cè)序?qū)悠分械目俁NA進(jìn)行定性和定量的測(cè)定 該方法能夠得到原始reads，格式為fastq。第一，使用cutadapt[10]去除對(duì)接頭序列。第二，使用fastx_toolkit (version 0.0.13)[11]軟件，將Q20質(zhì)控后的序列，保留將近80%。第三，使用NGSQCToolkit (version 2.3.2)[12]，過(guò)濾其中含有N堿基的reads，隨后進(jìn)行分析。將lean reads同Rfam (version 10.0)[13]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)結(jié)果，注釋出不同種類的RNA序列。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

透射電子顯微鏡觀察顯示，無(wú)論從健康還是患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液中獲得的外泌體均為大小不等的圓形至橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，可以見(jiàn)到清晰的膜結(jié)構(gòu)。囊泡粒徑大小多分布與50～150 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的30～150 nm基本一致(圖1)。

圖1 子宮腔液外泌體電鏡分析Fig.1 Electron microscopy analysis of exosomes in uterine cavity fluid

2.2 外泌體表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)鑒定結(jié)果

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白CD9的表達(dá)(圖2)結(jié)果顯示，無(wú)論健康還是患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液來(lái)源外泌體均表達(dá)其表面特異性標(biāo)記蛋白CD9。

圖2 子宮腔液來(lái)源外泌體CD9蛋白表達(dá)Fig.2 CD9 protein expression in exosomes from uterine cavity fluid

2.3 外泌體中RNA的4200檢測(cè)鑒定

將健康和患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液外泌體中提取的小RNA進(jìn)行Agilent 4200生物分析儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，miRNA條帶較為清晰(圖中標(biāo)注約為50 bp)，表明樣本中的RNA濃度和質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)要求(圖3)。

A1：健康牛，B1：患病牛圖3 RNA的4200檢測(cè)A1：cow with healthy，B1：cow with endometritisFig.3 RNA 4200 detection

2.4 外泌體中小RNA長(zhǎng)度變化鑒定

樣本中外泌體內(nèi)小RNA經(jīng)過(guò)clean reads的長(zhǎng)度分布檢測(cè)，結(jié)果顯示，健康奶牛子宮腔液外泌體內(nèi)小RNA的長(zhǎng)度與患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液外泌體內(nèi)小RNA的長(zhǎng)度相比較，健康奶牛子宮腔液外泌體中小RNA的長(zhǎng)度集中在30～31 nt，尤以31 nt較為密集，有9 483 354個(gè)；而患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液外泌體中的小RNA的長(zhǎng)度則集中在30～32 nt，其中最大的變化是長(zhǎng)度為32 nt的小RNA在健康中有647 490個(gè)，則在患子宮內(nèi)膜炎外泌體中的小RNA有2 729 501個(gè)，有著極其顯著的變化。但是患病來(lái)源外泌體中的小RNA長(zhǎng)度為32 nt明顯多于健康來(lái)源奶牛外泌體中的小RNA(圖4)。

圖4 子宮腔液exosomes外泌體中小RNA的長(zhǎng)度分布圖Fig.4 Length distribution of small RNA in exosomes

2.5 外泌體中各種小RNA的比例的鑒定結(jié)果

使用基因序列比較，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)reads進(jìn)行對(duì)比，使用blastn軟件，將不同種類結(jié)果中的提取E-value小于等于0.01的RNA進(jìn)行注釋。結(jié)果顯示，與健康奶牛子宮腔液外泌體中的小RNA相比，患病奶牛子宮腔液外泌體中rRNA、tRNA、SnRNA、Cis-reg、repeat、gene與unannotation等都有下降趨勢(shì)，尤其是repeat，從35 542下降至22 321。其中known-miRNA卻是明顯的上升，由1 073上升至1 245(圖5)。

圖5 外泌體中小RNA比例Fig.5 Proportion of small RNA in exosomes

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，健康奶牛與患奶牛子宮內(nèi)膜炎病的子宮腔液提取出的外泌體相比較，健康奶牛與患病奶牛外泌體直徑大小差異不大，但是健康奶牛子宮腔液外泌體中小RNA的長(zhǎng)度集中在長(zhǎng)度為30～31 nt，尤其長(zhǎng)度為31 nt較為密集；而患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮腔液外泌體中的小RNA的長(zhǎng)度則集中在30～32 nt。其中小RNA的各組成比例也發(fā)生了變化，為研發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的早期診斷標(biāo)記小RNA奠定了理論基礎(chǔ)。

外泌體是一種雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，在透射電子顯微鏡下觀察直徑為30～150 nm。外泌體在人體的體液中更加廣泛的存在，其中包括常見(jiàn)的尿液、血液、乳汁等[14-15]。在受到細(xì)胞外刺激、微生物感染和其他應(yīng)激等條件下都會(huì)影響外泌體分泌及組成成分[16]。研究證實(shí)[17-19]，外泌體在腫瘤診斷、遷移生長(zhǎng)、組織損傷修復(fù)、免疫抗原遞呈等方面都起著極其重要的作用。

目前為止，獲取外泌體有很多方法，包括離心法、沉淀法、超濾法、免疫親和法、微流控技術(shù)以及試劑盒提取等，每種方法都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。離心法提取外泌體純度高但卻費(fèi)時(shí)費(fèi)力，極易影響后續(xù)試驗(yàn)[15-16]；沉淀法使用十分方便，不需要專業(yè)設(shè)備，但雜蛋白污染多，且試劑昂貴；超濾法操作簡(jiǎn)單，快速，但回收率低且蛋白污染嚴(yán)重[20-21]；免疫親和法提取外泌體親和度和純度極高，但僅僅適用于無(wú)細(xì)胞樣品。本試驗(yàn)采用的試劑盒提取的外泌體，操作簡(jiǎn)單，純度高，能夠滿足本試驗(yàn)的要求。

外泌體中的小RNA在疾病中發(fā)生和發(fā)展中的作用，越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[22-23]。外泌體作為小RNA在細(xì)胞間的運(yùn)輸載體也是研究的熱點(diǎn)之一[24]。本研究中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎癥影響了子宮腔液中外泌體小RNA的組成和長(zhǎng)度分布，通過(guò)健康奶牛和患病奶牛子子宮腔液外泌體中的小RNA的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患病子宮內(nèi)膜炎外泌體中的小RNA的組成和小RNA的長(zhǎng)度分布與健康奶牛中外泌體有著明顯的差異。

總之，本研究證實(shí)奶牛患子宮內(nèi)膜炎癥改變子宮腔液外泌體中的小RNA的密集長(zhǎng)度以及分布比例的變化，為將外泌體內(nèi)小RNA應(yīng)用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的早期診斷奠定了理論基礎(chǔ)。