文/高妍 李德旺 過立農(nóng) 馬雙成 劉杰 鄭健 昝珂
重樓為傳統(tǒng)中藥中常用的大宗藥材,在傣族、蒙古族、苗族、藏族等多個民族中具有悠久的藥用歷史,是云南白藥、宮血寧、重樓解毒酊等81 種中成藥的主要原料[1,2]。其味苦、微寒,有清熱解毒、消腫止血、涼肝定驚等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,重樓在抗腫瘤、抑菌消炎、抗病毒、止血、止痛鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)等方面具有很好的活性[3-7]。重樓藥材及飲片為《中國藥典》2015年版一部收載品種,為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或 七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖[2]。依據(jù)拉丁名檢索,七葉一枝花對應(yīng)于《中國植物志》1978年版的中華重樓。云南重樓的化學(xué)成分有甾體皂苷類、甾醇、蛻皮激素、黃酮類等。其中甾體皂苷研究較多,并認為是重樓中最主要的活性物質(zhì)[8-12]。
有文獻報道,重樓屬植物全世界有24 種,中國有19 種,各品種在原植物特征和藥材性狀上具有相似性,僅依據(jù)根莖鑒定難度較大。已有研究發(fā)現(xiàn)[13,14],重樓的生長環(huán)境遭到破壞,植物繁殖率低,資源再生較慢,各產(chǎn)區(qū)藥材蘊藏量普遍下降。目前,在云南、四川等地已有規(guī)模較大的人工栽培基地[15-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)市場上重樓飲片多為云南重樓,且存在混偽品,例如以吉林延齡草充重樓飲片銷售的現(xiàn)象。因此,需要建立一種可以有效鑒別云南重樓的分析方法,以控制重樓藥材及飲片的質(zhì)量。
基于本課題組的前期研究基礎(chǔ)[8],本研究通過收集云南重樓、華重樓及偽品飲片樣品,采用UPLC 法建立了云南重樓特征圖譜。同時,計算云南重樓、華重樓和偽品的相似度,并開展聚類分析和主成分分析。本方法可以為重樓藥材和飲片的鑒別和安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。
Waters ACQUITY UPLC型高效液相色譜儀(包括自動進樣器,DAD 檢測器,柱溫箱,工作站);ELMA P120H 型超聲波清洗器(德國ELMA 公司);默克Milli-Q 純水系統(tǒng);Mettler XS 105 Du 十萬分之一天平(德國梅特勒公司);Mettler AE240萬分之一天平(德國梅特勒公司)。
藥材:云南重樓(編號為1~10),華重樓(編號為11~13),偽品(編號為14~20),樣品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院鄭健研究員鑒定,樣品信息見表1。
試藥:偽原纖細薯蕷皂苷(批號:Y19F7H9835, 純度98%)、重樓皂 苷H( 批號:Y21A9H68360, 純度98%)、纖細薯蕷皂苷(批號:CF0227QC14,純度98%)和重樓皂苷Ⅴ(批號:Y19F7H9835,純度98%)由上海源葉生物科技有限公司提供;重樓皂苷Ⅶ(批號:111593-201604, 純度94%)、重樓皂苷Ⅵ(批號:111592-201604, 純 度98%)、重樓皂苷Ⅱ(批號:111591-201604,純度96.1%)、薯蕷皂苷(批號:111707-201703,純度91.4%)、重樓皂苷Ⅰ(批號:111590-201604,純度93.6%)由中國食品藥品檢定研究院提供。
試劑:甲醇(色譜純,Lot.152023,F(xiàn)isher公司)和乙腈(色譜純,Lot.150942,F(xiàn)isher 公司),水為默克Milli-Q制超純水。
2.1.1 對照品溶液
分別精密稱取偽原纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ對照品適量于1 ml 量瓶中,以甲醇定容至刻度,即得各對照品儲備液。分別取各對照品儲備液適量于量瓶中,甲醇定容至刻度,即得對照品單標溶液。
表1 云南重樓、華重樓、偽品樣品信息
2.1.2 供試品溶液
本品粉末(過三號篩)約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25ml,稱定重量,加熱回流30 分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm);以乙腈為流動相A、水溶液為流動相B 進行梯度洗脫(表2);流速0.3 ml/min,進樣量10μl,柱溫40℃,檢測波長203 nm,記錄35 分鐘的色譜圖。
2.3.1 精密度試驗
按照“2.2”項下的色譜條件,精密吸取同一供試品溶液(編號:2)連續(xù)進樣6 次,每次10 μl,所得特征峰的相對保留時間的RSD 均<0.78%,特征峰的相對峰面積RSD 均<2.28% (n=6),表明儀器精密度良好。
2.3.2 穩(wěn)定性試驗
精密吸取同一供試品溶液(編號2),于配制后的0、4、8、12、16、24 小時進樣,所有特征峰的相對保留時間的RSD 均<1.13%、相對峰面積的RSD均<2.56%(n=6),表明供試品溶液在配制后24 小時內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.3 重復(fù)性試驗
取同一批號(編號:2)樣品,按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液,依法測定,所得特征峰的相對保留時間的RSD 均<0.96%,特征峰的相對峰面積 的RSD 均<2.87%(n=6),結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好。
2.4.1 云南重樓特征圖譜的建立
取10 批云南重樓樣品(樣品1 ~10)粉末,精密稱定,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,分別進樣測定,記錄35 分鐘的UPLC 色譜圖( 圖1)。 采用ChemPattern 化學(xué)計量學(xué)軟件(北京科邁恩科技有限公司)對實驗室數(shù)據(jù)進行分析處理,設(shè)定樣品1、3、7、10 為代表性圖譜生成共有模式圖,將其他樣品的色譜峰與共有模式圖進行自動匹配,生成云南重樓的特征圖譜(圖2),計算樣品1 ~10 與特征圖譜的相似度,分別為0.72、0.83、0.74、0.75、0.73、0.72、0.74、0.70、0.70、0.83,各批云南重樓正品之間的相似度均大于0.70,說明相似度良好。
表2 梯度洗脫程序
2.4.2 特征峰的標定
根據(jù)10 批云南重樓的特征圖譜檢測結(jié)果,共標定8 個特征峰,如圖2所示。經(jīng)過與對照品比對,并結(jié)合DAD 光譜,可知1 號峰為偽原纖細薯蕷皂苷、2號峰為重樓皂苷Ⅶ、3 號峰為重樓皂苷H、4 號峰為重樓皂苷Ⅱ、5 號峰為薯蕷皂苷、6 號峰為纖細薯蕷皂苷、7 號峰為重樓皂苷Ⅰ、8 號峰為重樓皂苷Ⅴ。
2.4.3 華重樓與云南重樓特征圖譜比較
圖1 10 批云南重樓UPLC 疊加圖
圖2 云南重樓UPLC 特征圖譜
圖3 3 批華重樓UPLC 疊加圖
取不同批次的華重樓(樣品11~13)粉末,精密稱定,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,分別進樣測定,記錄35 分鐘的UPLC 色譜圖(圖3),圖中主要包含3 個峰,其中1 號峰為重樓皂苷Ⅶ。華重樓與云南重樓特征圖譜的主要區(qū)別為:云南重樓中具有較高含量的薯蕷皂苷類成分,如重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷和重樓皂苷Ⅰ,而華重樓幾乎不含上述成分。 采 用ChemPattern 化 學(xué)計量學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理,計算樣品11~13 華重樓與特征圖譜的相似度,分別為0.32、0.26、0.37,可見華重樓和云南重樓特征圖譜差異大,存在顯著不同。
2.4.4 偽品與云南重樓特征圖譜比較
取不同批次的偽品(樣品14~20)粉末,精密稱定,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,分別進樣測定,記錄35 min的UPLC 色譜圖(圖4),圖中主要包含3 個峰,其中1 號峰為重樓皂苷Ⅶ,3 號峰為重樓皂苷Ⅵ。本實驗中收集到的偽品與云南重樓特征圖譜的主要區(qū)別為:云南重樓同時含有重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷和重樓皂苷Ⅰ,而偽品幾乎不含上述成分。同時,重樓皂苷Ⅵ為偽品的主要成分,云南重樓和華重樓中幾乎不含該成分。采用ChemPattern化學(xué)計量學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理,計算樣品14~20 偽品與特征圖譜的相似度,分別為0.18、0.22、0.22、0.19、0.15、0.17、0.20,可見偽品和正品特征圖譜差異大,存在顯著不同,可用于重樓的鑒別和質(zhì)量控制。
圖4 7 批偽品UPLC 疊加圖
圖5 云南重樓、華重樓及偽品相似度分析
云南重樓、華重樓和偽品相似度分析見圖5。
2.4.5 化學(xué)計量學(xué)分析
將色譜儀采集的數(shù)據(jù)以*.cdf格式導(dǎo)出,再導(dǎo)入ChemPattern化學(xué)計量學(xué)軟件,對相應(yīng)的色譜峰進行積分,按樣品對峰面積進行標準化處理,再進行聚類分析(圖6)和主成分分析(圖7)。如圖6和圖7所示,建立的特征圖譜方法采用聚類分析和主成分分析均能夠?qū)⒃颇现貥呛推渌麡悠罚ㄈA重樓、偽品)分成2 組,進一步,華重樓與偽品分為2 組,從而達到鑒別的目的。
圖6 云南重樓、華重樓及偽品聚類分析結(jié)果
圖7 云南重樓、華重樓及偽品主成分分析結(jié)果
本文選用UPLC 梯度洗脫法建立了云南重樓的特征圖譜,獲得了云南重樓化學(xué)成分的整體情況,35 分鐘內(nèi)完成分離。其主要成分偽原纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的分離效果良好。通過二極管陣列檢測器考察最適紫外吸收波長時,綜合考慮8 個主要成分的最大吸收,最終選擇203 nm 為檢測波長。
10 批云南重樓UPLC 圖譜與特征圖譜之間的相似度均大于0.70,相似度良好,表明各批次云南重樓的化學(xué)成分種類、比例相似,而3 批華重樓與特征圖譜之間相似度為0.26~0.37,說明《中國藥典》規(guī)定的重樓兩個正品品種云南重樓和華重樓化學(xué)成分存在差異;7 批偽品UPLC 圖譜與特征圖譜之間相似度均小于0.22,相似度較低,與正品化學(xué)成分差異較大。由聚類分析和主成分分析結(jié)果可知,兩種分析方式均能夠?qū)⒃颇现貥?、華重樓和偽品區(qū)分開來。由此可見,本文建立的特征圖譜可以有效區(qū)分云南重樓、華重樓和偽品,可以為控制重樓質(zhì)量提供依據(jù)。
《中國藥典》2015 版一部以重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅷ為指標成分對重樓藥材進行質(zhì)量控制,不能達到區(qū)分市場上云南重樓、華重樓和偽品的目的,尤其是以重樓投料生產(chǎn)的中成藥中,若摻入偽品,中成藥質(zhì)量將難以控制。本實驗建立了云南重樓的特征圖譜以區(qū)分云南重樓、華重樓和偽品,為有效控制重樓質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。