韓民，吳長偉，任笠坤，李星志，楊能紅，曾文英，潘耀振

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004）

膽道狹窄是指由各種因素導(dǎo)致的膽管管腔狹窄或閉塞，能引發(fā)膽汁引流不暢、肝功能受損和黃疸等臨床癥狀，分為良性和惡性膽道狹窄。良性膽道狹窄主要包括肝移植術(shù)、膽囊切除術(shù)和膽管結(jié)石等引起的炎癥性狹窄，以及膽管息肉、原發(fā)性硬化性膽管炎、外源性壓迫（Mirizzi綜合征、慢性胰腺纖維化）和各種損傷等引起的狹窄[1]。惡性膽道狹窄的發(fā)生主要與原發(fā)性膽管惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、膽囊癌、胰腺癌、壺腹癌和其他膽管部轉(zhuǎn)移癌相關(guān)。如何診斷膽道狹窄疾病的良惡性仍是當(dāng)前所面臨的難題。本研究隨機(jī)收集45例經(jīng)內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）顯示膽道狹窄并常規(guī)行膽道刷檢的患者，通過術(shù)后組織病理和臨床最終診斷，探討ERCP膽道刷檢對良惡性膽道狹窄疾病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月-2018年10月因梗阻性黃疸入住貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行ERCP診治，術(shù)中造影顯示膽道狹窄并行膽道細(xì)胞刷檢的患者45例，進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析。所有患者ERCP檢查前均經(jīng)腹部超聲（abdomen ultrasound，AUS）、CT、磁共振胰膽管造影（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）等無創(chuàng)影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)膽管有不同程度狹窄，但狹窄病因不能明確。未明確膽管狹窄性質(zhì)的診斷條件：①無明確病因，影像學(xué)檢查無轉(zhuǎn)移病灶征象；②無膽管結(jié)石；③無消化道腫瘤；④近期（＜3個月）無醫(yī)源性膽道損傷病史。排除伴有嚴(yán)重心肺疾病患者。本研究通過了貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審查，所有患者術(shù)前均被告知手術(shù)過程及相關(guān)風(fēng)險，并均簽署了知情同意書。

1.2 材料與方法

1.2.1 器械與耗材日本Olympus公司TJF 260V電子十二指腸鏡和十二指腸鏡活檢鉗；美國COOK公司三腔乳頭切開刀、黃斑馬導(dǎo)絲、DLB-35-1.5-S膽管細(xì)胞刷、球囊擴(kuò)張導(dǎo)管、柱狀擴(kuò)張球囊、膽道支架和鼻膽引流管等。

1.2.2 ERCP操作步驟患者完成術(shù)前檢查后，常規(guī)行靜脈麻醉。經(jīng)口腔插入十二指腸鏡，于十二指腸降段尋見乳頭，一次性弓形乳頭切開刀導(dǎo)絲引導(dǎo)下插入目標(biāo)膽管，再注入20%碘佛醇造影劑，明確病變狹窄部位，沿導(dǎo)絲將膽管細(xì)胞刷及外套管推入至病變上方后推出膽管細(xì)胞刷，在病變處反復(fù)上下刷取細(xì)胞學(xué)組織5次，細(xì)胞刷退回外套管一并拔出。常規(guī)涂片5張送病理細(xì)胞學(xué)檢查。

1.3 影像學(xué)和血清腫瘤標(biāo)記物檢測

所有患者在行ERCP前完善AUS、CT和MRCP等檢查，術(shù)前1～3 d空腹抽取靜脈血液5 ml，離心15 min，取上清液，血清標(biāo)本置于-20℃冰箱內(nèi)冰凍待測。酶聯(lián)免疫法檢測CA199、CA242和CA724。影像學(xué)檢查均由各專業(yè)內(nèi)同一醫(yī)師閱片。

1.4 膽道刷片制作過程

細(xì)胞刷退到外套管內(nèi)一起拔出后，立即將細(xì)胞刷放置載玻片上向同一個方向涂勻，涂片5張，涂片晾干后即刻放入95%乙醇固定15 min，常規(guī)蘇木素-伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE），2名副高以上病理醫(yī)師對刷片閱片，并進(jìn)行病理學(xué)診斷。

1.5 膽道狹窄最終診斷

1.5.1 惡性膽道狹窄診斷①外科手術(shù)切除標(biāo)本組織病理學(xué)檢查確診；②ERCP術(shù)中膽管腔內(nèi)活檢標(biāo)本組織病理學(xué)檢查確診；③未行手術(shù)或活檢者以臨床診斷、影像學(xué)檢查結(jié)合隨訪（＞12個月）結(jié)果得出最終診斷。

1.5.2 良性膽道狹窄診斷隨訪至少12個月，且疾病的臨床癥狀及影像學(xué)檢查無進(jìn)展。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，組間數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)秩和檢驗。膽道惡性狹窄的危險因素分析采用Logistic回歸分析，根據(jù)受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）計算出膽道惡性狹窄危險因素的Cutoff值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢查

所有患者ERCP造影前完善AUS、CT和MRCP等無創(chuàng)影像學(xué)檢查，各項影像學(xué)檢查中能確定狹窄部位影像結(jié)果見表1。

表1 各個狹窄部位影像學(xué)檢查結(jié)果 %Table 1 Imaging findings of various stenosis sites %

2.2 良惡性膽道狹窄患者的基本資料比較

良性膽道狹窄患者中，遠(yuǎn)端膽道狹窄比較常見（近端與遠(yuǎn)端區(qū)分以膽囊管匯合入肝總管處為界）。良惡性膽道狹窄患者在血清總膽紅素水平、間接膽紅素水平和膽道狹窄長度等方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義。45例患者中，32例（71.11%）診斷為惡性膽道狹窄，其中17例通過手術(shù)切除標(biāo)本組織病理學(xué)檢查確診，5例通過ERCP術(shù)中膽管腔內(nèi)活檢標(biāo)本組織病理學(xué)檢查確診，10例隨訪過程中疾病進(jìn)展及影像學(xué)檢查診斷為惡性膽道狹窄；16例患者診斷為膽管癌（6例肝門部膽管癌，10例遠(yuǎn)端膽管癌），2例患者診斷為膽囊癌，5例患者診斷為胰腺癌，4例患者診斷為十二指腸乳頭癌，5例患者診斷為十二指腸壺腹部癌。另外13例（28.89%）在≥12個月的隨訪過程中未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤證據(jù)，且疾病在臨床癥狀及影像學(xué)檢查無進(jìn)展，診斷為良性膽道狹窄。最終診斷為惡性膽道狹窄和良性膽道狹窄患者的基本資料比較見表2。

表2 惡性膽道狹窄患者與良性膽道狹窄患者基本資料比較 M（P25，P75）Table 2 Comparison of basic data between malignant and benign biliary strictures M（P25，P75）

2.3 膽道刷檢細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)

良性膽道狹窄患者細(xì)胞刷片在炎性背景下顯示出高度反應(yīng)性異型性，刷片中可見細(xì)胞核增大，染色加深，染色質(zhì)增粗，核漿比增大。見圖1。惡性膽道狹窄患者細(xì)胞刷片顯示細(xì)胞核增大，具有多個核仁，細(xì)胞質(zhì)稀少，核膜不規(guī)則，有多個核仁的染色質(zhì)凝集，核漿比增大，細(xì)胞異型性明顯，單個細(xì)胞呈惡性。見圖2。

2.4 惡性膽道狹窄的危險因素分析

在45例行ERCP造影顯示膽道狹窄的患者中，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，膽道狹窄長度是惡性膽道狹窄的危險因素（OR^=8.375，95%CI：1.249～56.173）。通過ROC曲線計算得出膽道狹窄長度的Cutoff值為1.55 cm，表明膽道狹窄長度大于1.55 cm時，惡性膽道狹窄的發(fā)生風(fēng)險增加。見表3和圖3。

圖1 炎性背景下具有反應(yīng)性高度異型性膽道細(xì)胞刷片F(xiàn)ig.1 Highly reactive atypical biliary tract cell brushes in inflammatory settings

圖2 膽道細(xì)胞刷片中具有不規(guī)則細(xì)胞核的惡性腫瘤細(xì)胞Fig.2 Malignant tumor cells with irregular nuclei in biliary tract cell brushes

表3 45例膽道狹窄患者進(jìn)展為惡性膽道狹窄的危險因素分析Table 3 Risk factors of malignant biliary stricture in 45 patients with biliary stricture

圖3 膽道狹窄長度ROC曲線圖Fig.3 ROC curve of biliary stenosis length

3 討論

3.1 膽道狹窄的內(nèi)鏡診療和并發(fā)癥

近年來，隨著AUS、CT、MRI和MRCP檢查的廣泛應(yīng)用，膽道狹窄相關(guān)疾病的診治水平有了進(jìn)一步提高。有研究[2-3]報道了MRCP聯(lián)合CT動態(tài)增強(qiáng)掃 描（CT dynamic contrast-enhanced scan，DCE-CT）診斷57例膽道狹窄患者的靈敏度和符合率，分別為96.67%和98.25%，對膽道狹窄良惡性的預(yù)測差異有統(tǒng)計學(xué)意義（AUC=0.994，P＜0.05）。ERCP作為膽胰疾病診治的重要手段，不僅能確定梗阻的性質(zhì)、部位和范圍，還可以行膽道細(xì)胞刷檢或活檢來進(jìn)行病理診斷。黃平等[4]報道了72例臨床可疑惡性膽管狹窄患者，在膽管狹窄的定性診斷上，ERCP+管腔內(nèi)超聲+細(xì)胞刷聯(lián)合檢測診斷膽管惡性狹窄的敏感性和準(zhǔn)確性分別為96.30%和97.22%，明顯高于任意單一檢測手段或兩種手段的聯(lián)合（P＜0.05）。對于早期膽道腫瘤患者，非手術(shù)獲得病理診斷，有助于正確診斷和指導(dǎo)進(jìn)一步治療，避免良性狹窄患者誤診為惡性而導(dǎo)致不必要的手術(shù)治療；對于失去手術(shù)機(jī)會的晚期腫瘤患者，細(xì)胞病理學(xué)診斷可為選擇放、化療等損傷性治療的時機(jī)、是否立即放置支架內(nèi)引流、選擇覆膜金屬內(nèi)支架還是裸支架等治療提供依據(jù)。本研究中，ERCP造影顯示膽道狹窄的患者共45例，15例采用合適口徑的水囊加壓擴(kuò)張至狹窄基本消失后，留置1根或多根塑料支架予以支撐；10例置入永久性金屬支架；根據(jù)最終診斷，32例惡性膽道狹窄患者中，16例診斷為膽管癌，2例診斷為膽囊癌，5例診斷為胰腺癌，4例診斷為十二指腸乳頭癌，5例診斷為十二指腸壺腹部癌。目前，有關(guān)研究報道膽道刷檢對膽道系統(tǒng)腫瘤的敏感度為40.00%～60.80%[5-7]；張筱鳳和DE BELLIS等[8-9]認(rèn)為，重復(fù)刷片可增加診斷的敏感性。BANK等[10]將一種新的膽道細(xì)胞刷（Infinity Cytology Device：刷毛長度2.4 mm，導(dǎo)管直徑9 Fr）與標(biāo)準(zhǔn)膽道細(xì)胞刷（Boston RX Cytology Brush：刷毛長度2.1 mm，導(dǎo)管直徑9 Fr）進(jìn)行比較，新的膽道細(xì)胞刷沒有提高膽道惡性狹窄診斷的準(zhǔn)確性。本研究采用COOK公司DLB-35-1.5-S膽管細(xì)胞刷（內(nèi)徑3.2 mm，長度2.50 cm），對ERCP造影顯示膽道狹窄的45例患者常規(guī)行膽道細(xì)胞刷檢，最終32例患者被診斷為惡性膽道狹窄，膽道刷檢的準(zhǔn)確率為71.11%，這比上述報道[10]有所提高。所有經(jīng)ERCP膽道刷檢患者，術(shù)后無出血、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生，1例（1/45，2.22%）發(fā)生輕型胰腺炎，經(jīng)保守治療后好轉(zhuǎn)。由此可見，ERCP膽道細(xì)胞刷檢是一項安全可靠的檢查方法，對良惡性膽道狹窄的鑒別有較好的價值。

3.2 膽道刷片細(xì)胞形態(tài)及意義

細(xì)胞形態(tài)是判斷腫瘤良性或惡性的依據(jù)，找到疑癌細(xì)胞或癌細(xì)胞能準(zhǔn)確反應(yīng)狹窄病變的性質(zhì)。雖然一些研究者明確地記錄了膽道刷片陽性或陰性的細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)，但細(xì)胞病理學(xué)中常出現(xiàn)一些異型細(xì)胞，使臨床醫(yī)師的診斷較困難，在制片過程中，細(xì)胞因聚集、壞死和炎癥會導(dǎo)致細(xì)胞模糊，以及制片技術(shù)限制等因素會導(dǎo)致惡性細(xì)胞的特征顯示不清，所以分化良好的腺癌細(xì)胞有時難以與異型增生細(xì)胞區(qū)別，從而無法做出正確判斷；當(dāng)膽道刷片檢查結(jié)果為低級別異型增生時，有可能實為高分化腺癌，也可能是慢性炎癥刺激導(dǎo)致的良性或反應(yīng)性改變。GERAMIZADEH等[11]報道了假陽性和惡性細(xì)胞學(xué)特征，假陽性膽道刷片細(xì)胞學(xué)改變的特征是：背景中有許多急性炎癥細(xì)胞存在細(xì)胞異型性，細(xì)胞呈片狀排列，伴有輕度的核重疊和（或）輕度的核增大，但其核膜光滑；細(xì)顆粒狀染色質(zhì)、小的核仁有時可成倍增多。本研究發(fā)現(xiàn)，13例良性膽道狹窄患者細(xì)胞刷片在炎性背景下顯示出高度反應(yīng)性異型性細(xì)胞，刷片中可見細(xì)胞核增大，染色加深，染色質(zhì)增粗，核漿比增大，其中1例患者通過手術(shù)切除組織，病理檢查最終診斷為慢性胰腺炎，這與上述研究者[11]報道相符。因此，在膽道刷片中出現(xiàn)明顯的炎性背景時，診斷時應(yīng)謹(jǐn)慎。高莉等[12]也描述了膽道刷片低級別異型增生、高級別異型增生的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)：低級別異型增生的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞排列呈單層或簇狀，有的呈乳頭狀排列，細(xì)胞核擁擠或稍有重疊，核增大，有的染色質(zhì)略增粗，有的可見小核仁，個別細(xì)胞核質(zhì)比增大，但多數(shù)胞質(zhì)較豐富；高級別異型增生的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞層次增多，核排列高低不齊，核增大，染色加深，染色質(zhì)增粗，核質(zhì)比增大，但細(xì)胞大小一致，黏附性好，刷片背景無壞死。同樣，本研究對32例惡性膽道狹窄患者膽道刷片細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)：細(xì)胞刷片顯示細(xì)胞核增大，核膜不規(guī)則，核仁明顯，具有多個核仁的染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)稀少，核漿比增大，細(xì)胞異型性明顯，常見小團(tuán)的散落的異型性細(xì)胞簇，且細(xì)胞黏附性差。這與文獻(xiàn)[13-16]描述的惡性膽道狹窄膽道刷片細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)相符。

3.3 惡性膽道狹窄的危險因素分析

本研究使用Logistic回歸模型對惡性膽道狹窄的危險因素進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)膽道狹窄長度是惡性膽道狹窄的危險因素，膽管狹窄長度越長，進(jìn)展為惡性膽道狹窄的危險性越高。吳林等[17]研究了121例未明確性質(zhì)的ERCP膽管刷片僅見異型細(xì)胞的患者，年齡、膽管狹窄長度、血清CA199水平及原發(fā)性硬化性膽管炎是膽管惡性狹窄的危險因素，當(dāng)患者年齡＞51.5歲、膽管狹窄長度＞1.75 cm、血清CA199水平高于122.05 u/ml和伴有原發(fā)性硬化性膽管炎時，膽管惡性狹窄的發(fā)生風(fēng)險明顯增加。還有研究[5，18]報道，ERCP膽道刷片見異型細(xì)胞的膽道狹窄患者有44.00%～71.00%最終可發(fā)展為惡性狹窄。本研究中，良惡性患者的膽道狹窄長度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，膽道狹窄長度（OR^=8.375，95%CI：1.249～ 56.173，P=0.029）是惡性膽道狹窄的危險因素，進(jìn)一步繪制ROC曲線圖，計算得出膽道狹窄長度的Cutoff值為1.55 cm。以上結(jié)果表明，膽道狹窄長度＞1.55 cm時，進(jìn)展為惡性膽道狹窄的危險性越高。

綜上所述，ERCP膽道細(xì)胞刷檢是一項安全可靠的檢查方法，對良惡性膽道狹窄的鑒別有較好的價值。充分的取材、良好的制片方法和嚴(yán)格的細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)以及各種輔助技術(shù)的合理應(yīng)用，惡性膽道狹窄的細(xì)胞病理學(xué)診斷將變得更加準(zhǔn)確，能提高膽道狹窄病變的診斷率與治療效果。由于本研究樣本例數(shù)少，仍需大樣本量、前瞻性隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗證。也期望在后續(xù)研究中采取一些新技術(shù)來提高膽道細(xì)胞刷片的診斷價值：如：基因突變檢測、蛋白免疫化學(xué)檢測、DNA倍體圖像分析技術(shù)和異倍體的熒光原位雜交檢測等。