單媛媛，劉葉虹萱，代雨柔，周 元，伊揚(yáng)磊，王 欣，劉變芳，呂 欣*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，畜禽的生產(chǎn)總量居世界前列，近年來(lái)，隨著人們對(duì)肉類(lèi)食品消費(fèi)量的增多，畜骨產(chǎn)量也在急劇增加，尤其牛骨產(chǎn)量增長(zhǎng)幅度最大[1]。牛骨占?；铙w質(zhì)量的6%～12%，主要特點(diǎn)是脂肪含量低，但蛋白質(zhì)及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)含量豐富，在食品醫(yī)藥方面具有廣泛的潛在用途[2]。但在目前牛骨消費(fèi)市場(chǎng)，除排骨和腔骨以原料的形式直接上市消費(fèi)外，不宜食用或口感較差的部分由于價(jià)格低及貯存不便，往往加工成飼料或肥料等附加值較低的產(chǎn)品或直接被廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3-4]。因此，充分利用骨類(lèi)資源，開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，對(duì)食品行業(yè)，尤其是肉類(lèi)加工業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

牛骨的化學(xué)組成受品種、年齡、飼養(yǎng)條件等多種因素的影響，變化較大，但硬骨的組成相對(duì)穩(wěn)定，硬骨中70%左右為以鈣鹽為主的礦物質(zhì)，98%以上的鈣鹽為磷酸鈣和碳酸鈣，因此動(dòng)物骨骼是天然的補(bǔ)鈣源[5]。由于牛骨中富含鈣磷，因而將其制成骨泥和骨粉作為鈣磷添加劑是利用骨資源的重要途徑[3]，但是由于骨骼鈣的羥基磷灰石水溶性極差，并且骨鈣通常與膠原纖維結(jié)合，使得骨粉中離子型鈣含量甚微[6]，如果直接食用骨泥或骨粉，鈣的吸收利用率非常低，必須經(jīng)過(guò)加工處理才能有效利用其中的鈣。目前報(bào)道的提高骨鈣溶解度方法主要有酸解法、堿解法、酶解法和微生物發(fā)酵法等[7-9]，這些方法可以在一定程度上提高骨鈣的溶出率，但是酸堿水解法會(huì)導(dǎo)致牛骨中蛋白質(zhì)的不可逆變性，其中效果較好的微生物發(fā)酵法中游離鈣的轉(zhuǎn)化率較低，僅為36.9%。近年來(lái)也有利用高壓脈沖電場(chǎng)[4,10-11]、感應(yīng)電場(chǎng)輔助技術(shù)[12]等高新技術(shù)進(jìn)行骨鈣溶出的研究，效果較好，但是需要特殊的設(shè)備。超聲波技術(shù)作為加速有機(jī)反應(yīng)的重要手段，具有機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)[13]，理論上可以破壞骨膠原與羥基磷灰石的結(jié)合，加速溶質(zhì)的擴(kuò)散，促進(jìn)有效物質(zhì)的溶出，提高反應(yīng)速率。超聲波輔助法在生物活性物質(zhì)的提取制備[14-17]、蛋殼源有機(jī)鈣的轉(zhuǎn)化[18-21]等方面已有廣泛的應(yīng)用，但在畜禽骨骼有機(jī)鈣的轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用報(bào)道很少。

鈣是人體不可或缺的重要營(yíng)養(yǎng)素，目前市場(chǎng)上的鈣制劑種類(lèi)很多，但均存在一定的局限性。作為新一代鈣源，檸檬酸鈣是一種無(wú)臭無(wú)味的白色粉末，它的吸收效率為普通碳酸鈣的2.6 倍，對(duì)腸胃刺激較小[22]，可以在醫(yī)藥行業(yè)用作人和動(dòng)物的補(bǔ)鈣劑，診治骨質(zhì)疏松癥[23-24]；在食品工業(yè)，檸檬酸鈣也是一種安全的食品添加劑、緩沖劑及酸度調(diào)節(jié)劑；檸檬酸鈣還被認(rèn)為是最具有潛在市場(chǎng)價(jià)值的飼料添加劑而用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[25-26]。此外，檸檬酸鈣能保證飼料不吸潮，并有效改良飼料風(fēng)味，提升動(dòng)物進(jìn)食量，緩解動(dòng)物對(duì)激烈現(xiàn)象做出的反應(yīng)，還能對(duì)動(dòng)物體形和肉色進(jìn)行改良，使肉的品質(zhì)得到提高。因此將牛骨中的羥基磷灰石轉(zhuǎn)化成易于被人體吸收的檸檬酸鈣具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究目的是探索一種利用超聲輔助直接中和法制備牛骨源檸檬酸鈣的新工藝，提高鈣的轉(zhuǎn)化效率，縮短反應(yīng)時(shí)間，提供鈣補(bǔ)充劑的同時(shí)解決廢棄牛骨造成的環(huán)境污染問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛長(zhǎng)骨 西北農(nóng)林科技大學(xué)菜市場(chǎng)；檸檬酸（食品級(jí)） 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院食品工藝研究室；NaOH、鹽酸、硝酸、碳酸鈣、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Na2（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDP-1000A型高速多功能粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；SHB-D(Ⅲ)循環(huán)水多用真空泵 河南省泰斯特儀器有限公司；R100型磁力攪拌器 上海佑科儀器儀表有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、SB-5200DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市國(guó)立實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所。

1.3 方法

1.3.1 牛骨預(yù)處理

牛長(zhǎng)骨清洗后粗碎成10～20 cm大小的骨塊，然后把骨塊在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸煮1 h。煮后的骨塊置于烘箱中40 ℃鼓風(fēng)干燥4 h后用多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)150 目篩備用。

1.3.2 超聲輔助法制備牛骨源檸檬酸鈣的工藝流程

稱(chēng)取一定量的牛骨粉置于燒杯中，加入一定比例的檸檬酸溶液，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中按照預(yù)先設(shè)定參數(shù)進(jìn)行超聲反應(yīng)，其中超聲3 s，間歇5 s。待反應(yīng)完成進(jìn)行抽濾，濾液加熱濃縮、干燥后用研缽碾碎，用細(xì)網(wǎng)紗布過(guò)濾后即得白色粉末狀檸檬酸鈣。

1.3.3 鈣離子化效率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[4]的方法略作改進(jìn)。即加入檸檬酸反應(yīng)結(jié)束后的濾液定容到50 mL，取5 mL溶液到250 mL錐形瓶中，加蒸餾水稀釋至50 mL。加氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至11～12之間，滴加2～3 滴鈣離子指示劑（鉻藍(lán)黑R），溶液變?yōu)榫萍t色后緩慢滴加EDTA-Na2溶液，邊滴邊搖勻，當(dāng)溶液從酒紅色變?yōu)樗{(lán)色且30 s不褪色即為滴定終點(diǎn)，記錄所消耗的EDTA-Na2的量，同時(shí)以蒸餾水為空白對(duì)照，記錄消耗EDTA-Na2的量。離子鈣溶出率按照式（1）計(jì)算：

式中：CEDTA為EDTA-Na2溶液的濃度/（mol/L）；V為樣品滴定時(shí)消耗EDTA-Na2體積/L；V0為空白對(duì)照消耗EDTA-Na2體積/L；β為稀釋倍數(shù)，10；m為骨粉的質(zhì)量/g；α為骨粉中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.4 檸檬酸鈣的純度和轉(zhuǎn)化率的測(cè)定[27]

采用減量法精確稱(chēng)量檸檬酸鈣粉末質(zhì)量m1，定容于100 mL容量瓶，每次取20 mL溶液于250 mL錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水，再用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至11～12，隨后滴加鈣指示劑搖勻。用EDTA標(biāo)準(zhǔn)液小心滴定樣品溶液，至酒紅色完全褪去，溶液呈純藍(lán)色，且30 s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗EDTA標(biāo)準(zhǔn)液的體積V。同時(shí)以蒸餾水為空白對(duì)照，記錄消耗EDTA標(biāo)準(zhǔn)液的毫升數(shù)記為V0。檸檬酸鈣純度按式（2）計(jì)算：

式中：V為樣品滴定時(shí)消耗EDTA-Na2體積/L；V0為空白對(duì)照消耗EDTA-Na2體積/L；CEDTA為EDTA-Na2溶液的濃度/（mol/L）；V總為檸檬酸鈣溶液的總體積/L；V滴為參加滴定的檸檬酸鈣溶液體積/L；M為檸檬酸鈣的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m1為檸檬酸鈣粉末的質(zhì)量/g。

檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率按照式（3）計(jì)算：

式中：m0為檸檬酸鈣粗粉的質(zhì)量/g；m為骨粉的質(zhì)量/g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

超聲輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的過(guò)程中影響鈣轉(zhuǎn)化率的因素較多，如超聲功率、時(shí)間、溫度、料酸比、料液比等。以離子鈣溶出率為衡量指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察上述因素對(duì)離子鈣溶出率的影響，每個(gè)水平重復(fù)3 次。

1.3.5.1 超聲功率對(duì)牛骨鈣溶出率的影響

在固定料液比為1∶15（g/mL）、料酸比（牛骨粉與檸檬酸的質(zhì)量比，下同）1∶1.5、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間10 min的條件下，考察超聲功率（0、50、100、150、200、250、300、350、400 W）對(duì)牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.2 超聲時(shí)間對(duì)牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、料液比1∶15（g/mL）、超聲功率250 W、超聲溫度30 ℃、超聲10 min的條件下，考察超聲時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30 min）對(duì)牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.3 超聲溫度對(duì)牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、料液比1∶15（g/mL）、超聲時(shí)間10 min的條件下，考察不同超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對(duì)牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.4 料酸比對(duì)牛骨鈣溶出率的影響

在固定料液比為1∶15（g/mL）、超聲功率200 W、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間10 min的條件下，考察料酸比（1∶0、1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）對(duì)牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.5 料液比對(duì)牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、超聲溫度為30 ℃、超聲時(shí)間10 min、超聲功率200 W的條件下，考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL））對(duì)牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求[28]，以超聲時(shí)間、超聲功率及超聲溫度為考察變量，檸檬酸鈣的轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為分析因子，5 個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5 次，以估計(jì)誤差，試驗(yàn)以隨機(jī)方式進(jìn)行，重復(fù)3 次。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and value of independent variables used for response surface design

1.3.7 超聲處理次數(shù)對(duì)離子鈣溶出率的影響

將骨粉（5.0 g）、水和檸檬酸按最佳配比混合均勻后，按響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行超聲波處理，離心得到上清液和骨渣，分別測(cè)定游離鈣的含量。離心分離得到的骨渣經(jīng)膠體磨研磨、干燥后，再重復(fù)上述步驟2 次，分別計(jì)算每次的離子鈣溶出率。

1.3.8 超聲處理對(duì)離子鈣溶出效果的驗(yàn)證

為驗(yàn)證超聲波輔助法對(duì)促進(jìn)牛骨可溶性鈣快速溶出的強(qiáng)化作用，將超聲輔助法與酸煮法得到的牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率進(jìn)行比較分析，同時(shí)設(shè)置靜置組（不超聲）和常規(guī)處理組（攪拌代替超聲），分析不同處理后溶液中檸檬酸鈣含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、料酸比、料液比對(duì)牛骨鈣離子化效果的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic power, sonication time, temperature, solidto-citric acid ratio and solid-to-solvent ratio on dissolution of free calcium from bovine bone

由圖1a可以看出，與對(duì)照組相比，超聲處理有助于牛骨鈣的離子化，在0～350 W范圍內(nèi)，離子鈣溶出率隨超聲功率增加而顯著提高，超過(guò)250 W以后，離子鈣溶出率增加幅度趨于平緩。分析其原因可能是因?yàn)楫?dāng)超聲功率在100～300 W時(shí)，在超聲波功率增加時(shí)，超聲波的空化作用和機(jī)械振動(dòng)增強(qiáng)有助于檸檬酸分子擴(kuò)散，提高傳質(zhì)速率，從而促進(jìn)檸檬酸與牛骨中的羥基磷灰石進(jìn)行反應(yīng)；此外，超聲波與料液作用產(chǎn)生大量的泡沫，泡沫破碎后產(chǎn)生局部瞬間壓力[29]，促使骨膠原斷裂也有利于牛骨鈣的溶出，因此從牛骨中釋放離子鈣的效率得到了改善。但是超過(guò)300 W以后，牛骨鈣的溶出率有所降低，可能因過(guò)高強(qiáng)度的超聲處理會(huì)導(dǎo)致生成的檸檬酸鈣發(fā)生降解或者性質(zhì)改變。出于能耗與生產(chǎn)周期等因素的綜合考慮，選擇300 W左右的超聲功率進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

從圖1b可以得出，在0～20 min內(nèi)，離子鈣溶出率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而上升，超出20 min后，離子鈣溶出率增加緩慢甚至下降。分析其原因，可能隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)了檸檬酸與牛骨中羥基磷灰石的接觸，加快反應(yīng)效率，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，所得到的檸檬酸鈣越多；但當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)20 min以后，超聲波的作用從牛骨顆粒表面擴(kuò)散到牛骨顆粒內(nèi)部，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)對(duì)牛骨顆粒產(chǎn)生影響，但是會(huì)使生成的檸檬酸鈣分解加速或使檸檬酸鈣的物理性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致超聲過(guò)程中絮凝，產(chǎn)生不同程度的沉淀[19]，直接阻礙了離子鈣含量的測(cè)定。因此，依據(jù)生產(chǎn)實(shí)際和成本考慮，選取超聲時(shí)間約為18～22 min進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1c可以看出，在0～40 ℃范圍內(nèi)，離子鈣溶出率隨超聲溫度升高而提高，當(dāng)超聲溫度達(dá)40 ℃時(shí)，牛骨鈣的離子化率顯著高于其他溫度時(shí)的離子鈣溶出率（P＜0.05），這是因?yàn)榉磻?yīng)溫度升高會(huì)加快溶質(zhì)的擴(kuò)散速率，有利于檸檬酸滲透并與牛骨顆粒接觸，因而更有利于反應(yīng)進(jìn)行。但是超過(guò)40 ℃以后，隨著超聲溫度的繼續(xù)升高，離子鈣溶出率反而下降，可能是由于溫度過(guò)高，檸檬酸鈣結(jié)晶導(dǎo)致溶解性下降，使測(cè)定的溶液中鈣含量降低[30]。因此，將超聲反應(yīng)溫度的范圍確定在35～45 ℃，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1d可以看出，離子鈣溶出率隨酸用量增加而提高，當(dāng)骨粉與檸檬酸的比例為1∶2時(shí)，鈣的離子化效率增加很快，超過(guò)此區(qū)間以后，離子鈣溶出率增加幅度趨于平緩。因此選擇料酸比1∶2作為最優(yōu)條件。

由圖1e可以看出，在料液比1∶15（g/mL）以下時(shí)，隨著溶劑用量的增大，離子鈣溶出率顯著上升（P＜0.05）。當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，離子鈣溶出率達(dá)到最大值73.0%，繼續(xù)增大料液比對(duì)離子鈣溶出率無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。原因可能與檸檬酸鈣在水中的溶解度有關(guān)，料液比在1∶15（g/mL）之前，轉(zhuǎn)化出的檸檬酸鈣不能完全溶于水中，導(dǎo)致測(cè)得離子鈣的含量降低。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)成本，選擇料液比1∶15（g/mL）進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL），以超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時(shí)間（X3）為試驗(yàn)因素，以檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

根據(jù)表2結(jié)果，通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率（Y）與超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時(shí)間（X3）之間建立二次回歸模型：

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

為進(jìn)一步分析所獲得的回歸方程的擬合度，對(duì)模型進(jìn)行了ANOVA方差分析，其結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯瑪M合方程的P值為0.005 6，這表明所獲得的方程在99%水平下具有顯著性。方程的失擬項(xiàng)（P＝0.057 9）不顯著，說(shuō)明方程的擬合程度較好，回歸方程可以很好地準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)各因素與鈣轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系。該模型一次項(xiàng)X1和交互項(xiàng)X1X2、X1X3的P值小于0.01，對(duì)模型貢獻(xiàn)大，因此其對(duì)牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化的影響極顯著，而一次項(xiàng)X2、X3和交互項(xiàng)X2X3的P值小于0.05，表明其對(duì)牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化的影響顯著。由F檢驗(yàn)可以得出各因素對(duì)牛骨檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率的影響依次是X1（超聲功率）＞X2（超聲溫度）＞X3（超聲時(shí)間）。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)回歸擬合方程，每2 個(gè)因素對(duì)牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率作響應(yīng)面和等高線圖（圖2）。通過(guò)觀察響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時(shí)間（X3）之間交互作用對(duì)牛骨檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率的影響，等高線的形狀越接近橢圓形，表明其自變量間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越大[16-17]。綜合分析可知，超聲溫度（X2）和超聲功率（X1）的交互作用對(duì)牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率的影響最為明顯。

圖2 各因素交互作用對(duì)檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 2 Response surface and contour plots showing interactive effects of variables on dissolution of free calcium from bovine bone

2.2.3 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

表4 不同處理方法牛骨源檸檬酸鈣的轉(zhuǎn)化率Table 4 Yields of calcium citrate prepared by different methods

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，確定超聲波輔助牛骨鈣離子化制備檸檬酸鈣的最佳工藝條件為：超聲功率317 W、超聲溫度39.45 ℃、超聲時(shí)間20.52 min、料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率為73.22%。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將各因素調(diào)整為：超聲功率320 W、超聲溫度39 ℃、超聲時(shí)間21 min、料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下進(jìn)行5 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)設(shè)置取消超聲處理和用常規(guī)方法代替超聲（反應(yīng)60 min）進(jìn)行比較。由表4可知，在超聲輔助的最佳工藝條件下，牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.21%，與理論預(yù)測(cè)值73.45%，誤差值僅為3.05%，證實(shí)了該模型的有效性。同時(shí)，在最佳工藝條件下檸檬酸鈣的純度為94.38%。超聲輔助反應(yīng)21 min比常規(guī)方法反應(yīng)60 min時(shí)的檸檬酸鈣的轉(zhuǎn)化率顯著提升，表明超聲波輔助在促進(jìn)牛骨有機(jī)鈣轉(zhuǎn)化的速率和效率方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.3 超聲波處理次數(shù)對(duì)牛骨鈣離子化效果的影響

在優(yōu)化出的最佳工藝參數(shù)基礎(chǔ)上，探索將牛骨鈣全部溶出的工藝，即將骨粉、水和檸檬酸按最佳配比混合均勻后，進(jìn)行超聲波處理，然后離心得到上清液和骨渣，分別測(cè)定游離鈣的含量（表5）。離心分離得到的骨渣經(jīng)膠體磨研磨后干燥后，再重復(fù)上述步驟2 次。牛骨粉只經(jīng)1次超聲處理后，骨中72.19%的鈣被游離出來(lái)；經(jīng)超聲波第2次處理后，仍有17.04%的離子鈣溶出，2次總離子鈣溶出率達(dá)89.23%；對(duì)牛骨粉進(jìn)行3 次循環(huán)超聲處理后，可溶性離子鈣溶出率達(dá)到96.18%，牛骨中的絕大部分鈣基本變?yōu)殡x子鈣。

表5 超聲處理次數(shù)對(duì)牛骨鈣離子化效果的影響Table 5 Effect of number of ultrasonic cycles on dissolution of free calcium from bovine bone

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了超聲波輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶15（g/mL）、料酸比1∶2.0、超聲功率320 W、超聲溫度39 ℃、超聲時(shí)間21 min，在此條件下獲得的檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化率為71.21%，檸檬酸鈣純度為94.38%。經(jīng)循環(huán)3 次超聲波處理后牛骨離子鈣溶出率高達(dá)96.18%。由響應(yīng)面方差分析和各因素交互作用分析各因素對(duì)牛骨源檸檬酸鈣轉(zhuǎn)化的影響順序?yàn)槌暪β剩境暅囟龋境晻r(shí)間，且超聲溫度和超聲功率對(duì)檸檬酸鈣得率的交互作用最為明顯。相對(duì)于常規(guī)方法，超聲波輔助制備工藝可顯著提升牛骨源檸檬酸鈣的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間，具有明顯優(yōu)勢(shì)。