閆芬芬，史佳鷺，李 娜，岳瑩雪，李慧臻，宋 月，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，典型臨床癥狀是高血糖，是由胰島素缺乏、胰島素抵抗或兩者兼有而導(dǎo)致的[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟將糖尿病分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他類型的糖尿病，其中2型糖尿病患者最多，占總患病人數(shù)的85%～95%，主要與全身炎癥[2]和氧化應(yīng)激[3]增加有關(guān)，分子和代謝機(jī)制與β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗有關(guān)[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，2015年全球成人糖尿病患者人數(shù)達(dá)到4.15億，預(yù)計(jì)到2040年這一數(shù)字將達(dá)到6.42億。此外，糖尿病患者逐漸變得年輕化，2017年青少年糖尿病全球發(fā)病率為8%，預(yù)計(jì)到2040年將達(dá)到10%[5]。中國(guó)已成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家，糖尿病患者超過1億。由于該疾病的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制和眾多影響因素，目前尚無有效的防治措施。

人體攝取的碳水化合物必須通過腸內(nèi)的關(guān)鍵消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）水解成葡萄糖單體，以被人體吸收。α-葡萄糖苷酶是一種存在于小腸黏膜刷狀緣的專門負(fù)責(zé)催化碳水化合物（低聚糖、二糖等）水解的水解酶[6-7]。因此，通過抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖已成為糖尿病臨床干預(yù)的有效靶點(diǎn)。臨床上使用的藥物主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。目前，研究發(fā)現(xiàn)一些α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過影響酶催化位點(diǎn)和模仿酶作用底物抑制該酶的活性[8-9]。阿卡波糖就是通過模仿酶作用底物治療糖尿病[10]。此外，有一些酶抑制劑不僅具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，而且還與酶的活性位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，從而通過這種競(jìng)爭(zhēng)性抑制延遲碳水化合物的消化和吸收，降低餐后血糖。二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是一種非常穩(wěn)定的細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶，在腸中高表達(dá)，此外在肝臟、胰腺、胎盤、胸腺等也有表達(dá)，部分以可溶形式存在于循環(huán)血液中，從而作用于組織和器官[11]。DPP-IV可以作用于生理激素，如胰高血糖素樣肽（GLP-1）、肽YY（PYY）等，從而減少其半衰期[12]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1在調(diào)節(jié)人體糖脂代謝中起重要作用。GLP-1可通過結(jié)合相應(yīng)的受體來減緩胃排空，抑制食欲，增加胰島素的分泌和降低胰高血糖素的分泌。GLP-1還可促進(jìn)β細(xì)胞增殖，抑制β細(xì)胞凋亡[13]。因此，抑制DPP-IV的活性，可增加GLP-1半衰期，促進(jìn)胰島素分泌。此外，GLP-1的促胰島素活性依賴于葡萄糖濃度，從而預(yù)防低血糖癥[14]。

近年來益生菌的健康效益越來越受到人們的關(guān)注，它在健康和疾病中起著重要作用[15]。益生菌在改善免疫系統(tǒng)功能和預(yù)防腹瀉方面具有良好的保健作用[16-17]。研究也證明益生菌具有改善炎癥，降低血脂、血糖，緩解代謝綜合癥的作用[18]。一些動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)了益生菌在緩解2型糖尿病中的作用。李向菲[19]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌可以降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、HOMA-IR指數(shù)、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-6，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖可以上調(diào)與GLP-1合成相關(guān)的基因的表達(dá)。Lactobacillus reuteri GMNL-263（109CFU/mL））可以顯著降低糖尿病大鼠的空腹血糖、胰島素、肝損傷標(biāo)志物、脂肪組織中的白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子，改善血液和肝臟中血脂代謝，增加PPAR-γ和GLUT4基因表達(dá)，增加糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量[20]。Jayashree等[21]研究發(fā)現(xiàn)，受試者攝入混合多種益生菌酸奶8 周后，糖化血紅蛋白、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6顯著降低。Ejtahed等[22]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者攝入含有益生菌的酸奶6 周后，空腹血糖、糖化血紅蛋白、氧化應(yīng)激參數(shù)均降低。然而也有研究顯示益生菌無論是單獨(dú)食用還是作為食物添加劑食用，均不能有效地降低血糖，緩解2型糖尿病[23]。盡管目前的研究結(jié)果存在差異，但并不能排除益生菌能夠緩解糖尿病的潛力。

本實(shí)驗(yàn)以中國(guó)傳統(tǒng)乳制品中分離出的13 株乳酸桿菌為研究對(duì)象。前期研究發(fā)現(xiàn)這些菌株具有抑菌活性[24]，抗氧化性能[25]以及降膽固醇[26]等功能?；谇叭搜芯?，首先根據(jù)菌株細(xì)胞代謝物（cell-free excretory supernatants，CFS）和細(xì)胞內(nèi)容物（cell-free extracts，CFE）對(duì)α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性的抑制率進(jìn)行降糖作用的篩選；在此基礎(chǔ)上，對(duì)篩選菌株進(jìn)行益生特性評(píng)價(jià)；最后通過主成分分析，從中篩選出性能最優(yōu)的降糖菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13 株乳酸桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，鼠李糖乳桿菌LGG ATCC 53103用作參考菌株，并已通過16S rRNA基因測(cè)序鑒定。

4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、甘氨酸-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽 美國(guó)Sigma公司；重組人DPPIV ProSpec 艾美捷科技有限公司；diprotin A強(qiáng)耀生物科技公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；CJ-2D超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；JY-92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Infinite?M1000 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及其菌落總數(shù)的測(cè)定

將凍存于-80 ℃甘油保藏的14 株乳酸桿菌以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2 次，第3次培養(yǎng)18 h后收集菌液，并將菌液濃度調(diào)節(jié)為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 CFS的制備

乳酸桿菌于MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min收集菌體。用無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 6.8）洗滌2 次，將菌體重懸于PBS中，并將細(xì)菌濃度調(diào)至1×109CFU/mL。37 ℃孵育12 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將上清液通過0.22 μm水系微濾膜過濾以獲得CFS，-80 ℃保存。

1.3.2.2 CFE的制備

乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)18 h后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min以收集菌體。無菌0.1 mol/L PBS（pH 6.8）洗滌2 次，菌體重懸于PBS中，將菌液濃度調(diào)至1×109CFU/mL，并在冰浴條件下超聲破碎。超聲破碎的條件為：功率200 W，以3 s-5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎15 min。超聲后的破碎液在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液通過0.22 μm水系微濾膜過濾以獲得CFE，-80 ℃保存。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[27]的方法，取96 孔微量滴定板，向反應(yīng)孔中加入25 μL 2.5 mmol/L PNPG和25 μL CFS或CFE；于37 ℃孵育10 min，再加入50 μL 0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶；37 ℃反應(yīng)15 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm處檢測(cè)反應(yīng)溶液的吸光度（A）。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，抑制率計(jì)算如式（1）所示：

式中：陽性為PNPG＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋酶＋Na2CO3；陰性為PNPG＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋Na2CO3；樣品為PNPG＋樣品＋酶＋Na2CO3；樣品空白為PNPG＋樣品＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋Na2CO3。

1.3.4 DPP-IV抑制活性的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[28]的方法，取96 孔微量滴定板，在反應(yīng)孔中加入25 μL 0.2 mmol/L甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯和25 μL CFS或CFE；于37 ℃孵育10 min，再加入50 μL 0.01 U/L DPP-IV；37 ℃反應(yīng)60 min，最后加入100 μL 1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.0）終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405 nm處檢測(cè)反應(yīng)溶液的吸光度。以抑二肽素作陽性對(duì)照，抑制率計(jì)算如式（2）所示：

式中：陽性為甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯胺＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋DPP-IV＋醋酸鈉緩沖溶液；陰性為甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯胺＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋Tris-HCl buffer＋醋酸鈉緩沖溶液；樣品為甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯胺＋樣品＋DPP-IV＋醋酸鈉緩沖溶液；樣品空白為甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯胺＋樣品＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋醋酸鈉緩沖溶液。

1.3.5 益生菌特性

1.3.5.1 酸耐受實(shí)驗(yàn)

4 株乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集菌體，菌體用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，重懸于PBS。處理后的菌體分別放入pH 2.0和pH 3.0的無菌PBS中，并調(diào)整菌體的濃度至109CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)0、1、2 h和3 h，取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果表示為lg（CFU/mL）。

1.3.5.2 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[29]的方法，4 株乳酸桿菌以2%接種量，接種于MRS（含有0.3%膽鹽）培養(yǎng)基中，37 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)8 h，每隔1 h檢測(cè)波長(zhǎng)620 nm處的吸光度，并將不含有膽鹽的MRS作為對(duì)照。膽鹽耐受能力用含有0.3%膽鹽MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，A620nm達(dá)到0.3 個(gè)單元所需的時(shí)間與不加膽鹽的MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯所需時(shí)間的差值表示。

1.3.5.3 疏水性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[30]的方法，將乳酸桿菌以2%接種量接在MRS液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃培養(yǎng)24 h，以同樣的方式培養(yǎng)3 代，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集18 h的菌體，用無菌的PBS（pH 7.4）沖洗2 次，最后懸浮于PBS（pH 7.4）中。將菌液的濃度調(diào)至1×108CFU/mL，并檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm處的OD值。取3.0 mL菌懸液分別與1.0 mL二甲苯、氯仿、乙酸乙酯混合，旋渦振蕩2 min后室溫靜置30 min，出現(xiàn)分層，小心吸取水層，600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定水相的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，根據(jù)式（3）計(jì)算疏水性：

1.3.6 主成分分析

首先篩選具有高α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性的菌株，然后對(duì)篩選菌株的α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性、酸耐受性、膽鹽耐受性、細(xì)胞疏水性指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，以期篩選出性能最優(yōu)的降糖菌株。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性分析和主成分分析，Origin 9.0進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的篩選

表1 乳酸桿菌對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Table 1 α-Glucosidase inhibitory rate of Lactobacillus

如表1所示，14 株乳酸桿菌的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶具有不同的抑制作用，抑制率為0%～12.13%。其中嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.1003和參考菌株LGG的CFS顯示出更好的抑制活性，分別為12.13%、10.29%和10.89%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0205、植物乳桿菌KLDS1.0318、KLDS1.0344、KLDS1.0386和德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207對(duì)α-葡萄糖苷酶活性無抑制作用。所有受試乳酸桿菌的CFE未顯示出對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

2.2 具有DPP-IV酶抑制活性菌株的篩選

表2 乳酸桿菌對(duì)DPP-IV活性的抑制率Table 2 DPP-IV inhibitory rate of Lactobacillus

由表2可以看出，14 株乳酸桿菌的CFS對(duì)DPP-IV表現(xiàn)出不同的抑制效果，抑制率為0%～7.13%。其中嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207的CFS顯示出較好的抑制活性，兩者分別為7.13%和5.47%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0911、植物乳桿菌KLDS1.0344和參考菌株LGG的CFS對(duì)DPP-IV無抑制作用。CFE對(duì)DPP-IV的抑制率為0%～55.42%，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901具有最高的抑制率55.42%，其次是嗜酸乳桿菌KLDS.1003，抑制率為50.14%，參考菌株LGG抑制率為6.22%。

2.3 益生菌特性分析

2.3.1 益生菌的酸耐受性

圖1 乳酸桿菌對(duì)pH 2.0和pH 3.0的酸耐受性Fig. 1 Viability of three selected strains at pH 2.0 or 3.0

由圖1可知，3 株受試菌株和1 株參考菌株對(duì)pH 3.0具有較強(qiáng)的耐受性，并且可以存活3 h。在pH 2.0的酸性條件下孵育1 h后，所有菌株的活菌數(shù)顯著下降；孵育2 h后，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.0902有存活菌數(shù)；孵育3 h后，僅有嗜酸乳桿菌KLDS1.0901有存活率。與所有其他菌株相比，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的酸耐受最強(qiáng)。

2.3.2 益生菌的膽鹽耐受性

表3 乳酸桿菌的膽鹽耐受性Table 3 Effect of bile on the growth rate of selected strains

從表3可以看出，4 株乳酸桿菌能夠在含0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。其中菌株LGG的膽鹽耐受性最好，滯后時(shí)間最短為2.06 h，嗜酸乳桿菌KLDS1.0902對(duì)膽鹽的耐受能力最差，滯后時(shí)間最長(zhǎng)為3.26 h，但嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和LGG差異不顯著（P＞0.05），說明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和LGG更能耐受腸道膽鹽環(huán)境。

2.3.3 益生菌的疏水性

圖2 乳酸桿菌的表面疏水性Fig. 2 Cell surface hydrophobicity of selected strains

圖2 為4 株乳酸桿菌在二甲苯、乙酸乙酯和氯仿3 種有機(jī)溶劑中疏水性的結(jié)果。在二甲苯溶劑中，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和KLDS1.0901的疏水性較高，疏水率分別為134.33%和130.58%，而LGG具有最低的疏水性。在乙酸乙酯溶劑中，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的疏水性最高，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。在氯仿溶液中，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003具有最高的疏水性，疏水性為344.08%。通常，高疏水性的菌株對(duì)細(xì)胞具有強(qiáng)黏附性，疏水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003具有較好的疏水性，該菌株可能具有較強(qiáng)的黏附能力。

2.3.4 主成分分析

圖3A為各個(gè)特性在各主成分中占的載荷分布圖。第1主成分可以解釋4 個(gè)特性：其成分載荷分別為酸耐受性0.982、CFE對(duì)DPP-IV的抑制性0.920、在乙酸乙酯中的疏水性0.867、在二甲苯中的疏水性0.845；第2主成分主要解釋3 個(gè)特性：膽鹽耐受性-0.787、在氯仿中的疏水性0.785、CFS對(duì)DPP-IV的抑制性0.726、CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制性0.564。

圖3B展示了所選益生菌的分布，根據(jù)圖3B和表4可以看出，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的綜合得分最高，為1.21，明顯高于其他3 種菌株，LGG的綜合得分最低。該結(jié)果表明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003可用作潛在的降糖益生菌。

圖3 主成分分析的因子載荷圖（A）和因子得分圖（B）Fig. 3 Loadings and scores plots of principle components analysis

表4 因子得分Table 4 Scores of fi rst two principal components

3 討 論

以實(shí)驗(yàn)室保藏的13 株乳酸桿菌為研究對(duì)象，從菌株的CFS和CFE分析菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶和DPP-IV的抑制活性，以期篩選出能夠通過抑制α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性而發(fā)揮降糖作用的益生菌。糖尿病的典型臨床癥狀為高血糖。因此，在糖尿病早期階段控制糖尿病患者的餐后血糖尤為重要。通過抑制人體糖代謝吸收的關(guān)鍵酶（α-葡萄糖苷酶）的活性，減少葡萄糖的吸收，從而降低餐后高血糖的影響。目前，臨床上常見的α-葡萄糖苷酶抑制藥物對(duì)人體有不可忽視的副作用。因此，近年來關(guān)于植物多糖[31]、黃酮[32]等天然物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究增多。本實(shí)驗(yàn)研究了乳酸桿菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果表明，多數(shù)菌株的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，尤其是嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.1003的抑制率達(dá)到了10%及以上，抑制作用明顯，并且與參考菌株LGG無顯著差異。然而，包括參考菌株在內(nèi)的所有受試菌株的CFE都沒顯示出α-葡萄糖苷酶抑制作用。田芬等[33]研究發(fā)現(xiàn)，77 株益生菌中僅有13 株菌的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，所有菌株的CFE對(duì)該酶沒有抑制作用，與本研究結(jié)果一致。Zeng Zhu等[34]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌液濃度為1×1010CFU/mL時(shí)，LGG的CFS和CFE對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，抑制率分別為28.3%和2.5%；菌株ZF06-3、IF13和IF2-17的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為34.9%、28.0%和18.7%，但是3 株菌的CFE均未表現(xiàn)出抑制作用，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)最終篩選得到的嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的CFS的α-葡萄糖苷酶抑制活性為12.13%，該結(jié)果低于Zeng Zhu等[34]的結(jié)果，可能是由菌濃度較低導(dǎo)致的。此外，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的CFS的酶抑制率與商業(yè)菌株LGG無顯著差異（P＞0.05）。目前，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性[35]。此外，有研究顯示一些小分子肽也可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性[36]。

DPP-IV抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，11 株乳酸桿菌的CFS對(duì)DPP-IV有抑制作用，而商業(yè)菌株LGG未表現(xiàn)出抑制作用。除菌株KLDS1.0207外，其他菌株的CFE均表現(xiàn)出不同的DPP-IV抑制活性，并且有6 株乳酸菌的抑制率高達(dá)10%及以上，抑制作用明顯。此外，CFE的酶抑制率普遍高于CFS。Zeng Zhu等[34]研究發(fā)現(xiàn)LGG的CFS對(duì)DPPIV的抑制率為9.2%，CFE的抑制率為14.6%；其他受試菌株也都表現(xiàn)出不同的酶抑制活性，CFE的抑制率普遍高于CFS，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CFS對(duì)酸堿、溫度不敏感，但是對(duì)蛋白酶敏感，CFS經(jīng)蛋白酶處理后酶抑制活性增大，說明可能是CFS中的蛋白或肽類物質(zhì)發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的最優(yōu)菌株為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003，CFS的DPP-IV抑制率為7.13%，與Zeng Zhu等[34]的結(jié)果相比其抑制率較低，這可能與菌液濃度和DPP-IV的來源有關(guān)。Lacroix等[37]比較研究了一些食源蛋白的天然肽序列對(duì)豬和人源DPP-IV的抑制特性，結(jié)果顯示，不同天然肽表現(xiàn)出的抑制活性在兩種酶間有顯著差異。張穎[38]研究發(fā)現(xiàn)合成肽對(duì)豬源DPPIV的抑制作用比對(duì)人源DPP-IV更加敏感。

為保證所選益生菌能夠有效發(fā)揮降糖作用，本研究又對(duì)酶抑制性較好的菌株進(jìn)行了益生特性的評(píng)價(jià)。在酸耐受實(shí)驗(yàn)中，選擇pH 2.0和pH 3.0進(jìn)行了研究，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、KLDS1.0901、KLDS1.0902和LGG在pH3.0的酸性條件下均有較高的存活率，在pH 2.0的酸性條件下孵育3 h，僅菌株KLDS1.0901能夠部分存活。Matsumoto等[39]研究發(fā)現(xiàn)菌株的耐酸能力大小與菌株的H＋-ATP酶活性有關(guān)。因此，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的酸耐受性很可能與該酶活性有關(guān)。在膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)中，在0.3%膽鹽條件下，4 株菌的生長(zhǎng)滯后時(shí)間不一，其中商業(yè)菌株LGG的膽鹽耐受性最好，滯后時(shí)間為2.06 h，其次為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003，但二者差異不顯著（P＞0.05）。有研究報(bào)道顯示，有些乳酸菌能夠調(diào)節(jié)一些主要負(fù)責(zé)保持細(xì)胞膜完整性基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)膽汁鹽耐受性[40]。此外，某些乳酸菌能夠通過膽鹽水解酶水解膽汁鹽降低膽鹽的影響[41]。在疏水性實(shí)驗(yàn)中，各菌株間有所差異，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.1003的疏水性明顯高于菌株LGG和KLDS1.0902。

4 結(jié) 論

本研究所篩選出的具有高α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性的菌株為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、KLDS1.0901和KLDS1.0902，而它們的益生特性有所不同。主成分分析對(duì)α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制率及益生特性進(jìn)行綜合評(píng)估，結(jié)果表明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的得分最高，具有良好的耐受性和降糖潛力。