曾 靜，郭建軍，涂熠坤，魏國汶，袁 林,*

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南京工業(yè)大學化學與分子工程學院，江蘇 南京 211800）

生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化溫度條件下直接作用于未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉顆粒，在淀粉液化過程中能夠省去生淀粉糊化步驟，有利于節(jié)約能源和簡化工藝，因此生淀粉α-淀粉酶在釀造、食品、造紙、紡織等領域具有巨大的應用潛力[1-5]。生淀粉α-淀粉酶具有結(jié)合到淀粉顆粒表面的淀粉結(jié)合域（starch binding domain，SBD），這是它能夠直接水解未經(jīng)糊化處理的生淀粉顆粒的關鍵[6-7]。SBD屬于碳水化合物結(jié)合分子[8-9]，作為淀粉酶的天然部分主要有以下作用：使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物（淀粉顆粒）結(jié)合，將底物運送到催化結(jié)構域的活性位點致使淀粉顆粒表面破裂[6-7]。SBD中芳香族氨基酸殘基參與生淀粉顆粒的結(jié)合，芳香族氨基酸殘基的分布會影響其生淀粉結(jié)合能力[10]。已有研究顯示一些生淀粉酶的生淀粉結(jié)合能力和生淀粉降解性能存在相關性，即生淀粉結(jié)合能力降低，其生淀粉降解性能也降低。例如，Mehta等[11]通過對Gt-amy II進行SBD缺失突變研究，發(fā)現(xiàn)缺失SBD的突變體的生淀粉結(jié)合能力和生淀粉降解性能明顯降低。但是SBD的生淀粉結(jié)合能力與生淀粉α-淀粉酶的生淀粉降解性能之間是否存在正相關性，以及SBD影響生淀粉α-淀粉酶的生淀粉降解性能的分子機制還有待進一步研究。

來源于嗜熱菌（Geobacillus thermoleovorans）的α-淀粉酶Gt-amy屬于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶，具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，并且Gt-amy的酶學性質(zhì)（如熱穩(wěn)定、低pH值、不依賴于Ca2＋）使得其在淀粉液化工藝中具有巨大的應用潛力[12]。Gt-amy屬于糖苷水解酶類的第13家族，具有保守區(qū)域、催化活性中心、金屬離子結(jié)合位點和3 個結(jié)構域（結(jié)構域A、結(jié)構域B和結(jié)構域C）等[13-16]。Gt-amy的結(jié)構域C和來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶SBD序列比對結(jié)果表明，二者氨基酸序列相似性達95%，Gt-amy的結(jié)構域C可能為SBD[12,17]。

蛋白質(zhì)環(huán)化重排是對蛋白質(zhì)進行分子改造的一種有效手段，是通過共價連接氨基端和羧基端，裂解某個肽鍵重新獲得新的氨基端和羧基端的過程[18]。采用環(huán)化重排處理使得蛋白質(zhì)的分子結(jié)構發(fā)生改變，從而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如提高蛋白質(zhì)催化能力、配體親和性、改變底物選擇性、改變低聚反應狀態(tài)和提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等[19]。例如，Stephen等[20]對糖化酶RoGA的SBD進行環(huán)化重排突變，獲得了生淀粉結(jié)合率提高的突變體CP90。本研究擬采用基于蛋白質(zhì)分子結(jié)構的環(huán)化重排方法對Gt-amy的結(jié)構域C進行分子改造，獲得結(jié)構域C的環(huán)化重排突變體，并用結(jié)構域C的環(huán)化重排突變體替換Gt-amy中結(jié)構域C獲得對應的Gt-amy環(huán)化重排突變體。通過比較環(huán)化重排突變體的生淀粉吸附率和生淀粉降解率，分析Gt-amy的生淀粉結(jié)合能力與生淀粉降解性能之間是否存在相關性，以及闡述結(jié)構域C影響Gt-amy催化性能的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB600、枯草芽孢桿菌表達載體pSTOP1622、Gt-amy表達載體pSTOP1622-gtamyhds均由本實驗室保存。

KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國Omega Bio-Tek公司；In-Fusion?HD Cloning kit 日本TaKaRa公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國GE Healthcare公司；玉米淀粉 美國Sigma公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、木糖、咪唑 上海生工生物工程股份有限公司；實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Mastercycler gradient聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設備有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析

采用Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org）），以來源于Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶BStA（PDB ID：1hvxA）蛋白質(zhì)分子結(jié)構為模板，模擬Gt-amy結(jié)構域C（Tyr428～Pro549）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構[21]。將Gt-amy結(jié)構域C的蛋白質(zhì)分子結(jié)構信息（模擬得到的三級結(jié)構信息）輸入到在線軟件Cpred（http：//sarst.life.nthu.edu.tw/CPred）[22]中，得出SBD結(jié)構中每一個氨基酸殘基作為環(huán)化重排突變的概率，選擇環(huán)化重排突變概率高的氨基酸殘基位點進行突變。

1.3.2 重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-DCh的構建及鑒定

以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，獲得編碼結(jié)構域C的基因gtamy-DCh。PCR擴增條件為：94 ℃、5 min預變性；94 ℃、30 s變性，55 ℃、20 s退火，68 ℃、20 s延伸，35 個循環(huán)；68 ℃、10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)BglII和SphI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-DCh。采用BglII和SphI雙酶切重組質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

1.3.3 Gt-amy結(jié)構域C環(huán)化重排突變體的構建及鑒定

表1 構建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

根據(jù)α-淀粉酶Gt-amy結(jié)構域C中作為環(huán)化重排突變位點的氨基酸位點設計引物T432-F1、T432-R1、D441-F1、D441-R1、P454-F1、P454-R1、G465-F1、G465-R1、A479-F1、A479-R1、S491-F1、S491-R1、S498-F1、S498-R1、G508-F1、G508-R1（表1），構建結(jié)構域C相關環(huán)化重排突變體DC-T432、DC-D441、DC-P454、DCG465、DC-A479、DC-S491、DC-S498、DC-G508。以突變體DC-T432的構建為例，以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-DCh為模板，采用引物T432-F1和T432-R1，進行PCR擴增得到編碼DC-T432的DNA片段。PCR擴增條件同1.3.2節(jié)。擴增產(chǎn)物經(jīng)BglII和SphI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-DCT432h。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行比對確認。

1.3.4 Gt-amy環(huán)化重排突變體的構建及鑒定

根據(jù)α-淀粉酶GT-amy結(jié)構域C中作為環(huán)化重排突變位點的氨基酸位點設計引物P3、P4、T432-F2、T432-R2、D441-F2、D441-R2、P454-F2、P454-R2、G465-F2、G465-R2、A479-F2、A479-R2、S491-F2、S491-R2、S498-F2、S498-R2、G508-F2、G508-R2（表1），構建Gt-amy相關環(huán)化重排突變體Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G465、Gt-amy-A479、Gt-amy-S491、Gt-amy-S498、Gt-amy-G508。以突變體Gt-amy-T432的構建為例，以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyh為模板，以P3、P4為引物，進行PCR擴增得到不包含編碼結(jié)構域C的核苷酸序列的線性載體片段。PCR擴增條件除延伸時間為3 min外，其他同1.3.2節(jié)。以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-DCT432h為模板，以T432-F2、T432-R2為引物，PCR擴增得到包含同源臂和編碼突變體DC-T432的核苷酸序列的DNA片段（5’-ATCGCGCGCAGGGAT-DCT432核苷酸序列-CACCATCACCATCAC-3’）。將PCR擴增的線性片段與DNA片段混合，采用In-Fusion?HD Cloning kit進行無縫克隆，獲得Gt-amy環(huán)化重排突變體Gt-amy-T432的表達載體pSTOP1622-gtamy-T432h。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行比對確認。

1.3.5 枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化

枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進的Spizizen法[23]進行。

1.3.6 重組蛋白質(zhì)的誘導表達和純化

接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中培養(yǎng)，裝液量20 mL，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)培養(yǎng)10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。當培養(yǎng)至菌體OD600nm達到1時，添加終質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL的木糖，誘導細胞表達重組蛋白質(zhì)，誘導時間為30 h。

采用Ni2＋親和層析柱對發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進行純化，用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組蛋白質(zhì)。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測重組蛋白質(zhì)的純度，并采用Bradford法測定重組蛋白質(zhì)的濃度[24]。

1.3.7 重組蛋白質(zhì)對玉米淀粉的吸附率及降解率的測定用0.5 m L 5 0 m m o l/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）（pH 5.0）緩沖液配制玉米淀粉溶液（其中玉米淀粉質(zhì)量分別為0、25、50、75、100、125、150 mg），分別向玉米淀粉溶液中加入50 μL的重組蛋白質(zhì)（60 μmol/L），混合體系在20 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。孵育結(jié)束后，12 000×g離心10 min，獲得沉淀和上清液。采用Bradford法測定上清液中重組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。吸附率計算如式（1）所示：

取30 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液與0.1 U/mg的酶液混合，于60 ℃反應3 h后，用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）[25]法測定上清液中還原糖量。α-淀粉酶的玉米淀粉降解率按式（2）計算：

1.3.8α-淀粉酶活力測定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉或玉米淀粉的50 mmol/L MES，pH 5.0緩沖液混合，于80 ℃反應30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應，然后采用DNS法測定反應體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.9α-淀粉酶的動力學常數(shù)測定

用50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液（0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5 g/100 mL），分別向可溶性淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.3.8節(jié)方法測定酶活力。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標，以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計算以可溶性淀粉為底物時的米氏常數(shù)Km、反應常數(shù)kcat。

1.4 數(shù)據(jù)處理

α-淀粉酶的酶學性質(zhì)研究實驗中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 11.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gt-amy結(jié)構域C中環(huán)化重排突變位點的選擇

采用S w i s s-M o d e l，以來源于B a c i l l u s stearothermophilus的α-淀粉酶BStA（PDB ID：1hvxA）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構為模板，模擬Gt-amy結(jié)構域C（Tyr428～Pro549）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構如圖 1所示，其中所獲得的結(jié)構域C的三級結(jié)構圖僅能顯示氨基酸序列Tyr428～Arg517所構成的蛋白質(zhì)分子結(jié)構。結(jié)構域C中每一個氨基酸殘基作為環(huán)化重排突變位點的概率如圖2所示，選擇環(huán)化重排突變概率高的氨基酸殘基位點進行突變。由圖2可知，結(jié)構域C中可以作為環(huán)化重排突變位點的氨基酸殘基如下：第432位蘇氨酸（T432）、第441位天冬氨酸（D441）、第454位脯氨酸（P454）、第465位甘氨酸（G465）、第479位丙氨酸（A479）、第491位絲氨酸（S491）、第498位絲氨酸（S498）、第508位甘氨酸（G508）。根據(jù)以上信息，構建得到結(jié)構域C環(huán)化重排突變體（DC-T432、DC-D441、DC-P454、DC-G465、DC-A479、DC-S491、DC-S498、DC-G508）的表達載體。在此基礎上，采用結(jié)構域C環(huán)化重排突變體替換Gt-amy的結(jié)構域C，構建得到Gt-amy環(huán)化重排突變體（Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G465、Gt-amy-A479、Gt-amy-S491、Gtamy-S498、Gt-amy-G508）的表達載體。

圖1 Gt-amy結(jié)構域C的三級結(jié)構顯示圖Fig. 1 Tertiary structure of domain C of Gt-amy

圖2 結(jié)構域C中環(huán)化重排突變位點的概率圖Fig. 2 Probability of circulation permutation sites in domain C of Gt-amy

2.2 重組蛋白質(zhì)的表達與純化

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。結(jié)構域C環(huán)化重排突變體和Gt-amy環(huán)化重排突變體均得到成功表達，且主要位于細胞可溶成分中。采用Ni2＋親和層析柱對重組細胞可溶成分中的目的蛋白質(zhì)進行純化，得到純化后的重組蛋白質(zhì)，如圖3、4所示。結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體的表觀分子質(zhì)量約為13 kDa，Gt-amy及其環(huán)化重排突變體的表觀分子質(zhì)量約為56 kDa，大小均與理論值相符。

圖3 結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體的SDS-PAGE檢測圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of domain C and circularly permutated mutants

圖4 Gt-amy及其環(huán)化重排突變體的SDS-PAGE檢測圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of Gt-amy and circularly permutated mutants

2.3 重組蛋白質(zhì)對玉米淀粉的吸附率

為研究結(jié)構域C的環(huán)化重排突變對其結(jié)合玉米淀粉的影響，比較結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率，結(jié)果如圖5所示。在玉米淀粉質(zhì)量濃度為0～30 g/100mL范圍內(nèi)，結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率隨著反應體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度的提高而提高。當反應體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度達到30 g/100 mL時，結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率達到最高。此外，在玉米淀粉質(zhì)量濃度0～30 g/100 mL范圍內(nèi)，與野生型的結(jié)構域C相比，突變體DC-T432、DC-D441、DC-P454、DC-G508對玉米淀粉的吸附率降低；而突變體DC-G465、DC-S491以及DCS498對玉米淀粉的吸附率提高；突變體DC-A479對玉米淀粉的吸附率基本不變。并且，當反應體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度達到30 g/100 mL時，突變體DC-S498對玉米淀粉的吸附率達到95.78%，而結(jié)構域C對玉米淀粉的吸附率為84.52%。即以上重組蛋白質(zhì)中，DC-S498具有最大值的玉米淀粉吸附率，與結(jié)構域C的玉米淀粉吸附率相比，提高了13%。以上結(jié)果表明，結(jié)構域C的環(huán)化重排突變通過改變結(jié)構域C的分子結(jié)構，使得其對玉米淀粉的吸附率發(fā)生變化。

圖5 結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體的玉米淀粉吸附率Fig. 5 Raw corn starch binding rates of domain C and circularly permutated mutants

圖6 Gt-amy及其環(huán)化重排突變體的玉米淀粉吸附率Fig. 6 Raw corn starch binding rates of Gt-amy and circularly permutated mutants

另外，本研究也進一步比較了Gt-amy及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率，結(jié)果如圖6所示。在玉米淀粉質(zhì)量濃度為0～30 g/100 mL范圍內(nèi)，Gt-amy及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率的變化趨勢與結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率變化趨勢基本一致。在玉米淀粉質(zhì)量濃度為0～30 g/100 mL范圍內(nèi)，與野生型的結(jié)構域C相比，突變體Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508對玉米淀粉的吸附率降低；而突變體Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498對玉米淀粉的吸附率提高；突變體Gt-amy-A479對玉米淀粉的吸附率基本不變。當反應體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度達到30 g/100 mL時，突變體Gt-amy-S498對玉米淀粉的吸附率達到93.14%，而Gt-amy對玉米淀粉的吸附率為78.86%。即以上重組蛋白質(zhì)中，Gt-amy-S498具有最大值的玉米淀粉吸附率，與Gt-amy的玉米淀粉吸附率相比，提高了18%。

以上研究結(jié)果表明，結(jié)構域C的環(huán)化重排突變導致其分子結(jié)構發(fā)生改變，從而改變其對玉米淀粉吸附率。當將Gt-amy中結(jié)構域C替換為結(jié)構域C的環(huán)化重排突變體后，Gt-amy對玉米淀粉的吸附率也發(fā)生改變。并且Gtamy及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率的變化情況與結(jié)構域C及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的吸附率的變化情況一致。結(jié)構域C的環(huán)化重排突變導致玉米淀粉吸附率發(fā)生改變的可能原因是，結(jié)構域C的環(huán)化重排突變使其分子結(jié)構發(fā)生變化，特別是結(jié)構域C中參與生淀粉吸附的氨基酸位點在分子結(jié)構中的分布發(fā)生了變化[26]。

2.4 重組蛋白質(zhì)對玉米淀粉的降解率

圖7 Gt-amy及其環(huán)化重排突變體的玉米淀粉降解率Fig. 7 Raw corn starch hydrolysis rates of Gt-amy and circularly permutated mutants

為研究結(jié)構域C環(huán)化重排突變對Gt-amy降解玉米淀粉的影響，本研究也比較了Gt-amy及其環(huán)化重排突變體對30 g/100 mL玉米淀粉的降解率。由圖7可以看出，Gt-amy及其環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的降解率隨著時間的延長而提高。此外，與Gt-amy相比，突變體Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508對玉米淀粉的降解率降低；而突變體Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498對玉米淀粉的降解率提高；突變體Gt-amy-A479對玉米淀粉的降解率基本不變。其中，當反應時間達到3 h，突變體Gt-amy-S498具有最大值的玉米淀粉降解率，其對玉米淀粉的降解率為90.93%，而Gt-amy對玉米淀粉的降解率為65.80%。即與Gt-amy相比，突變體Gt-amy-S498的玉米淀粉降解率提高了38%。以上研究結(jié)果表明，結(jié)構域C的環(huán)化重排突變影響了Gt-amy對玉米淀粉的降解率。

結(jié)合結(jié)構域C環(huán)化重排突變對Gt-amy的玉米淀粉吸附率和玉米淀粉降解率影響的研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：玉米淀粉吸附率提高的Gt-amy環(huán)化重排突變體，其玉米淀粉降解率也相應提高；玉米淀粉吸附率降低的Gt-amy環(huán)化重排突變體，其玉米淀粉降解率也相應降低。并且突變體的玉米淀粉吸附率和玉米淀粉降解率之間只有相對應的提高和降低關系，即兩者之間未呈倍數(shù)關系，但呈正相關性。已有研究結(jié)果顯示，提高淀粉酶的生淀粉吸附能力，可以相應提高其生淀粉降解率。例如，Parashar等[27]通過分子改造獲得的玉米淀粉吸附率由0.6 μg/mg提高至10 μg/mg的Ba-amy嵌合突變體，其玉米淀粉降解率由5.0%提高至25.6%。

2.5 結(jié)構域C的環(huán)化重排突變對Gt-amy催化活性的影響

表2 可溶性淀粉為底物的重組α-淀粉酶動力學常數(shù)Table 2 Kinetic parameters of recombinant α-amylase with soluble starch as substrate

表3 玉米淀粉為底物的重組α-淀粉酶動力學常數(shù)Table 3 Kinetic parameters of recombinant α-amylase with corn starch as substrate

比較Gt-amy及其環(huán)化重排突變體對可溶性淀粉和玉米淀粉的酶比活力和動力學常數(shù)，確定結(jié)構域C的環(huán)化重排突變對Gt-amy催化活性的影響。從表2可以看出，以可溶性淀粉為底物時，與Gt-amy相比，Gt-amy環(huán)化重排突變體的可溶性淀粉吸附能力未明顯改變，反應速率和酶比活力略有下降。從表3可以看出，以玉米淀粉為底物時，與Gt-amy相比，Gt-amy環(huán)化重排突變體對玉米淀粉的Km、kcat值和酶比活力均發(fā)生明顯變化。其中，突變體Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508對玉米淀粉的吸附能力明顯降低，反應速率和酶比活力也明顯降低；而突變體Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498對玉米淀粉的吸附能力明顯提高，反應速率和酶比活力也明顯提高；突變體Gt-amy-A479對玉米淀粉的Km、kcat值和酶比活力與Gt-amy基本一致。

以上研究結(jié)果表明，結(jié)構域C環(huán)化重排突變后，生淀粉吸附能力越高的Gt-amy突變體的生淀粉降解能力也越高，但是結(jié)構域C環(huán)化重排突變對Gt-amy的可溶性淀粉降解能力影響不大。Gt-amy環(huán)化重排突變體以可溶性淀粉為底物時反應速率和酶比活力略有下降的可能原因是結(jié)構域C的環(huán)化重排突變導致酶分子結(jié)構發(fā)生變化，特別是與Gt-amy高溫活性相關的分子結(jié)構發(fā)生了變化。已有研究表明，位于Gt-amy的結(jié)構域A與結(jié)構域C之間的Ca2＋結(jié)合位點有利于其維持其高溫活性[28-29]。結(jié)構域C環(huán)化重排后，此Ca2＋結(jié)合位點相關的氨基酸殘基重新排布，破壞了此Ca2＋結(jié)合位點，進而導致突變體的高溫活性降低。

Gt-amy的氨基酸序列比對結(jié)果顯示，Gt-amy的結(jié)構域C可能為SBD。SBD介導生淀粉酶作用于生淀粉的機理為SBD結(jié)構域可以與生淀粉結(jié)合從而增加在酶活性中心的生淀粉質(zhì)量濃度，并且改變生淀粉的結(jié)構構象使得其更加接近活性中心[30]。因此SBD生淀粉吸附能力的增強可能會提高生淀粉酶對生淀粉的降解能力，生淀粉酶的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之間可能存在正相關性。本研究通過對Gt-amy的結(jié)構域C進行環(huán)化重排突變，證實Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之間存在正相關性。

3 結(jié) 論

本研究通過分析Gt-amy及其環(huán)化重排突變體的玉米淀粉吸附率、玉米淀粉降解率、酶比活力和動力學常數(shù)，確定了Gt-amy結(jié)構域C環(huán)化重排突變對其催化性能的影響。結(jié)構域C環(huán)化重排突變后，生淀粉吸附能力越高的Gt-amy突變體的生淀粉降解能力也越高，但是結(jié)構域C環(huán)化重排突變對Gt-amy的可溶性淀粉降解能力影響不大。本研究通過對Gt-amy的結(jié)構域C進行環(huán)化重排突變，提高或降低了Gt-amy的生淀粉吸附能力，進而提高或降低了Gt-amy的生淀粉降解能力，證實Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之間存在正相關性。但是從Gt-amy結(jié)構域C的模擬分子結(jié)構尚不能預測其中生淀粉結(jié)合位點，因此有關結(jié)構域C環(huán)化重排突變影響Gt-amy生淀粉吸附能力和生淀粉降解能力的分子機制有待進一步研究。此外本研究也驗證了環(huán)化重排突變可以作為一種工程學手段改變Gt-amy的催化性能，特別是生淀粉降解能力，同時將來也可以將環(huán)化重排突變用于改變其他酶類的蛋白質(zhì)結(jié)構與功能，為提高蛋白質(zhì)的催化性能提供了思路。