蘭曉勇，劉素純，2*，李再貴

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

苦蕎麥是國際糧農(nóng)組織公認的藥食兼用糧種，富含蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、淀粉、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)素[1-2]，具有保肝、補腎、造血及增加免疫功能作用，被稱為“三降食品”和“21世紀人類的健康食品”[3]。

苦蕎中含有蛋白質(zhì)、脂肪、脂肪酸和氨基酸，營養(yǎng)價值高于小麥、玉米、大米等大宗糧食作物，苦蕎不僅含有其他糧食谷物所不具有的黃酮類化合物，而且蕎麥中含有豐富的無機鹽和維生素，包括鉀、鎂、銅、硒，維生素B、C、E等[4-6]。

冠突散囊菌（Eurotium cirstatum）屬子囊菌綱，曲霉目，曲霉科，散囊菌屬的真菌，其形成的子囊孢子附著于茶葉表面，具有明顯香味，俗稱“金花”[7]。研究表明，冠突散囊菌在生長代謝過程中會分泌多種胞外酶[8]（如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等），這些酶將纖維素、果膠、多糖等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)。其他霉菌進行發(fā)酵使物料表面覆蓋大量菌絲，而且?guī)в胁涣济刮叮虼吮驹囼灁M采用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵苦蕎，以苦蕎總蛋白、苦蕎清蛋白、球蛋白、醇蛋白和谷蛋白為考察指標，通過單因素試驗和單因素條件優(yōu)化苦蕎固態(tài)發(fā)酵條件，來提高蛋白含量，為以后開發(fā)苦蕎相關(guān)產(chǎn)品提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：長沙市高橋農(nóng)貿(mào)市場；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：從湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶分離；氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、鹽酸、碳酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍-G250、牛血清蛋白、酪氨酸均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-25085-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；TP-620A電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；DGG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；XMTD 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠；FW135中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SP-752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；722N可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎發(fā)酵樣品的制備

發(fā)酵劑制備：按苦蕎∶水料液比為1∶0.5（g∶mL）制作培養(yǎng)基，121 ℃滅菌25 min，接入斜面冠突散囊菌，28 ℃培養(yǎng)4 d，裝入無菌紙袋置45 ℃烘箱中烘干，作為冠突散囊菌發(fā)酵劑。

苦蕎與水按一定比例混勻后，裝一定厚度的物料入500 mL三角瓶中，在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。冷卻后加入1%的冠突散囊菌發(fā)酵劑，置一定溫度發(fā)酵一定時間后，放入烘箱中，45 ℃烘干，粉碎機粉碎后過40目篩，收集篩下物為實驗樣品，密封保存。

苦蕎清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白提取方法參考Osborne法[9]。

1.3.2 不同條件對苦蕎蛋白和蛋白酶的影響

發(fā)酵時間：將苦蕎按照1.3.1處理，苦蕎與水料水比按1∶0.6（g∶mL）混勻后，使物料厚度分別為1.0 cm，放在28 ℃培養(yǎng)箱中，分別測定發(fā)酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d苦蕎蛋白含量和蛋白酶活性。

物料厚度：將苦蕎按照1.3.1處理，苦蕎與水料水比按1∶0.6（g∶mL）混勻后，使物料厚度分別為1.0 cm、1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm、3.0 cm，放在28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d測其蛋白含量和蛋白酶活性。

發(fā)酵溫度：將苦蕎按照1.3.1處理，苦蕎與水料水比按1∶0.6（g∶mL）混勻后，使物料厚度分別為1.0 cm，分別放在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d測其蛋白含量和蛋白酶活性。

固液比：將苦蕎按照1.3.1處理，苦蕎與水的料水比分別為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2（g∶mL），物料厚度為1.0 cm，放在28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d測其蛋白含量和蛋白酶活性。

1.3.3 發(fā)酵對苦蕎抗氧化能力的影響

將苦蕎按照1.3.1處理，苦蕎與水料水比按1∶0.6（g∶mL）混勻后，使物料厚度分別為1.0 cm，放在28 ℃培養(yǎng)箱中，分別測定發(fā)酵0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d苦蕎的抗氧化能力，探討發(fā)酵對抗氧化能力的影響。

1.3.4 測定方法

蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍法[10]；苦蕎總蛋白提取：總蛋白的提取參考文獻[11]；蛋白酶活性：采用Folin-酚試劑法[12]。

發(fā)酵苦蕎體外抗氧化能力的測定：在試管中加入不同時間發(fā)酵的1.0 g苦蕎粉，加入一定體積的水，混合均勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液作為待測樣品?？偪寡趸芰?、超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）清除率的測定：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響

不同發(fā)酵時間對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 發(fā)酵時間對苦蕎中4種蛋白含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on four kinds of protein contents in tartary buckwheat

由圖1可知，在發(fā)酵期間，隨發(fā)酵時間的延長，苦蕎清清蛋白含量先升高后降低，發(fā)酵4 d時清蛋白含量最高為24.12 mg/g，比未發(fā)酵時高2.95 mg/g；球蛋白含量先升高后降低，在6 d時含量最高為20.41 mg/g，比未發(fā)酵時高3.88 mg/g；醇蛋白含量逐漸增加，在10 d時含量達到5.49 mg/g，比未發(fā)酵時高4.21 mg/g；谷蛋白在發(fā)酵期間含量沒有明顯變化（P＞0.05）。

由圖2可知，在0～8 d，蛋白酶的活性逐漸在增加，8 d時蛋白酶活性達到最高為32.08 U/g；在0～4 d期間，苦蕎總蛋白質(zhì)含量隨著發(fā)酵時間的延長不斷增加，4 d之后，總蛋白質(zhì)含量降低，4 d時苦蕎蛋白質(zhì)最高為104.46 mg/g，比未發(fā)酵高10.79 mg/g。冠突散囊菌在生長繁殖期間，會分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶[13]，這些酶將蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，同時為自身代謝活動提供碳源和能源。前期蛋白酶活性低，而纖維素酶、淀粉酶的活性高，纖維素酶能分解細胞壁，促使內(nèi)含物溶出，從而增加了可溶性固形物含量[14]，造成發(fā)酵過程中蛋白含量變化呈由增加變?yōu)闇p少趨勢。

圖2 發(fā)酵時間對總蛋白含量和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on total protein contents and protease activity

2.2 不同物料厚度對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響

不同物料厚度對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 物料厚度對苦蕎中4種蛋白含量的影響Fig.3 Effect of material thickness on four kinds of protein contents in tartary buckwheat

由圖3可知，隨著物料厚度的增加，苦蕎總蛋白含量先減少后增加，物料厚度為1.0 cm時，總蛋白質(zhì)的含量達到最高為86.69 mg/g；清蛋白含量先減少后增加，清蛋白含量最高為20.09 mg/g；球蛋白含量先增加后減少，物料厚度為2.0 cm時，球蛋白含量最高為22.34 mg/g；醇蛋白含量先增加后減少，物料厚度為2.5 cm時，醇蛋白含量最高為4.36 mg/g；發(fā)酵期間谷蛋白的含量沒有明顯變化（P＞0.05）。

由圖4可知，隨著物料厚度的增加，蛋白酶的活性在持續(xù)的升高，總蛋白質(zhì)的含量不斷的降低，在物料厚度為1.0cm時，蛋白酶的活性最低為24.89 U/g，總蛋白質(zhì)的含量達到最高為86.69 mg/g；在物料厚度為2.5 cm時，蛋白酶的活性最高為31.57 U/g，總蛋白質(zhì)的含量最低為66.05 mg/g。由于物料的厚度會對物料的通氣性能產(chǎn)生影響，物料厚度過高不利于氧氣的擴散[15]，進而影響冠突散囊菌的生長繁殖過程，使其影響了酶活性，影響了蛋白質(zhì)含量。

圖4 物料厚度對總蛋白含量和蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of material thickness on total protein contents and protease activity

2.3 不同發(fā)酵溫度對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響

不同發(fā)酵溫度對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 發(fā)酵溫度對苦蕎中4種蛋白含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on four kinds of protein contents in tartary buckwheat

圖6 發(fā)酵溫度對總蛋白含量和蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on total protein contents and protease activity

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，苦蕎總蛋白含量先降低后增加，24 ℃時達到最高為94.10 mg/g；清蛋白的含量先減少后增加，發(fā)酵溫度為32 ℃時，清蛋白含量最高為22.75 mg/g；球蛋白含量先增加后減少，發(fā)酵溫度為28 ℃時，球蛋白含量最高為20.77 mg/g；醇蛋白含量先增加后減少，發(fā)酵溫度為30 ℃時，醇蛋白含量最高為4.73 mg/g；谷蛋白在發(fā)酵溫度為24～32 ℃之間，含量沒有明顯變化（P＞0.05）。

由圖6可知，在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵溫度的升高，蛋白酶活性先升高后降低，總蛋白含量先降低后升高。24 ℃時蛋白酶活性最低為12.21 U/g，總蛋白含量達到最高為94.10 mg/g；30 ℃時蛋白酶活性最高為31.48 U/g，總蛋白含量最低為76.91 mg/g。發(fā)酵溫度的高低影響著冠突散囊菌的生長，發(fā)酵溫度也影響其菌體酶活性，進而影響了蛋白質(zhì)的含量。溫瓊英[16]對冠突散囊菌進行溫度培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明冠突散囊菌在28 ℃時生長最快。

2.4 不同固液比對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響

不同固液比對苦蕎蛋白及蛋白酶的影響結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 固液比對苦蕎中4種蛋白含量的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio on four kinds of protein contents in tartary buckwheat

圖8 固液比對總蛋白含量和蛋白酶活力的影響Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on total protein contents and protease activity

由圖7可知，隨著固液比的增加，苦蕎總蛋白含量先降低后增加，固液比為1∶1.2（g∶mL）時，總蛋白含量最高為90.86 mg/g；清蛋白含量先降低后增加，固液比為1∶0.4（g∶mL）時，清蛋白含量最高為20.52 mg/g；球蛋白含量先增加后減少，固液比為1∶0.6（g∶mL）時，球蛋白含量最高為20.41 mg/g；醇蛋白含量先增加后減少，醇蛋白在固液比為1∶0.8（g∶mL）時含量最高為4.34 mg/g；谷蛋白含量隨著固液比的變化而沒有明顯變化（P＞0.05）。

由圖8可知，發(fā)酵過程中隨著固液比的增加，蛋白酶活性先升高后降低，總蛋白含量先降低后升高。在固液比為1∶0.8（g∶mL）時，蛋白酶活性最高為32.17 U/g，總蛋白含量最低為65.33 mg/g；在固液比為1∶1.2（g∶mL）時，蛋白酶活性最低為22.72 U/g，總蛋白含量最高為90.86 mg/g。水分活度是反映存在于物質(zhì)中微生物新陳代謝的可利用自由水的量度[17]，降低水分活度將會導致微生物生長停滯期的延長，代謝活性的降低，繁殖能力降低，降低了微生物產(chǎn)生酶的活性[18-19]。所以水分含量太低影響冠突散囊菌的生長，進而影響菌產(chǎn)生酶的活性，水分含量太高會使菌吸水膨脹，影響菌的生長。

2.5 發(fā)酵對苦蕎抗氧化能力的影響[20-21]

2.5.1 發(fā)酵苦蕎總抗氧化的能力

圖9 發(fā)酵苦蕎的總抗氧化能力Fig.9 Total antioxidant ability of fermented tartary buckwheat

由圖9可知，未發(fā)酵苦蕎的總抗氧化能力為1.09 mmol/g，發(fā)酵6 d的苦蕎總抗氧化能力最高為1.25 mmol/g，比未發(fā)酵苦蕎的總抗氧化能力高14.7%；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵苦蕎的總抗氧化能力增強，6 d時達到最大，隨后總抗氧化能力逐漸下降?？嗍w總抗氧化能力可能與其球蛋白含量有關(guān)。

2.5.2 發(fā)酵苦蕎抑制超氧陰離子的能力

圖10 發(fā)酵苦蕎抑制超氧陰離子自由基的能力Fig.10 Inhibition of fermented tartary buckwheat on superoxide anion radical

由圖10可知，在發(fā)酵期間，苦蕎發(fā)酵產(chǎn)物的抑制超氧陰離子能力高于未發(fā)酵的苦蕎，未發(fā)酵苦蕎的抑制超氧陰離子的能力為327.59 U/L，發(fā)酵8 d的抑制超氧陰離子的能力最強為956.90 U/L，抑制超氧陰離子的能力是未發(fā)酵苦蕎的1.92倍。超氧陰離子的抑制能力可能與發(fā)酵后苦蕎的醇蛋白含量的增加有關(guān)。

2.5.3 發(fā)酵苦蕎抑制羥自由基的能力

圖11 發(fā)酵苦蕎抑制羥自由基的能力Fig.11 Inhibition of fermented tartary buckwheat on hydroxyl radical

由圖11可知，在發(fā)酵期間，苦蕎發(fā)酵產(chǎn)物對羥基自由基的抑制作用高于未發(fā)酵的苦蕎，未發(fā)酵苦蕎抑制羥自由基的能力為319.87 U/mL，發(fā)酵6 d的苦蕎抑制羥自由基的能力為403.28 U/mL，是未發(fā)酵苦蕎的0.26倍，表明發(fā)酵后苦蕎對羥基自由的抑制作用增強。在發(fā)酵期間，隨著發(fā)酵時間的延長，苦蕎抑制羥自由基能力逐漸升高，6 d時達到最大，隨后開始下降?？嗍w抑制羥自由基能力可能與球蛋白含量有關(guān)。

2.5.4 發(fā)酵苦蕎DPPH自由基清除能力

圖12 發(fā)酵苦蕎DPPH自由基清除率Fig.12 DPPH radical scavenging rate of fermented tartary buckwheat

由圖12可知，在發(fā)酵期間，苦蕎發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率增大，未發(fā)酵苦蕎對DPPH自由基清除率為37.5%，發(fā)酵4 d的苦蕎對DPPH自由基清除率最高為68.4%，比未發(fā)酵苦蕎高30.9%。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵苦蕎對DPPH自由基的清除率逐漸增大，4 d時達到最大，隨后發(fā)酵苦蕎對DPPH自由基的清除率呈下降趨勢?？嗍wDPPH自由基清除率可能與總蛋白、清蛋白含量有關(guān)。

3 結(jié)論

通過對發(fā)酵條件的4個單因素進行試驗探討苦蕎蛋白含量及抗氧化能力的變化得出，苦蕎經(jīng)冠突散囊菌在一定條件下的發(fā)酵，清蛋白含量為24.61 mg/g，比未發(fā)酵高3.44 mg/g；球蛋白含量為21.31 mg/g，比未發(fā)酵高4.78 mg/g；醇蛋白含量為5.83 mg/g，比未發(fā)酵高4.55 mg/g；谷蛋白在發(fā)酵期間沒有明顯變化（P＞0.05）。發(fā)酵條件對苦蕎總蛋白、清蛋白、球蛋白和醇蛋白的含量影響較大，對谷蛋白的含量影響較小。在一定發(fā)酵條件下，蛋白酶活性影響著苦蕎總蛋白的含量。發(fā)酵后的苦蕎體外抗氧化能力比未發(fā)酵的總抗氧化能力、抑制超氧陰離子能力、抑制羥自由基能力、DPPH自由基清除能力均有不同程度的提升。該研究結(jié)果對苦蕎的開發(fā)具有指導意義。