宋書會(huì)，張金堯，汪 洪

［中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，國(guó)家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全肥料源性因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100081］

氮是植物生長(zhǎng)需求的主要營(yíng)養(yǎng)元素，土壤氮主要包括有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮兩種主要形態(tài)，是評(píng)價(jià)土壤供氮能力的指標(biāo)，無(wú)機(jī)氮主要包括NO2-、NO3-、可交換態(tài)NH4+和被黏土固定的不可交換態(tài)NH4+，有機(jī)氮主要存在于土壤有機(jī)質(zhì)、植物殘?bào)w中，有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮通過(guò)固定、礦化作用相互轉(zhuǎn)化［1］。在土壤科學(xué)、植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域?qū)ν寥罓I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、植物營(yíng)養(yǎng)吸收等的研究均需測(cè)定土壤全氮含量［2］。

土壤全氮含量的測(cè)定主要為濕燒法和干燒法。凱氏定氮法為濕燒法，是傳統(tǒng)的土壤全氮含量測(cè)定方法，主要包括蒸餾和滴定，首先用硫酸消煮土壤樣品，將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮以NH4+的形式存在，之后再測(cè)定消煮液中的銨。此方法之后被不斷改進(jìn)，主要為催化劑的使用和NH4+-N的測(cè)定，在消煮過(guò)程中可用K2SO4、CuSO4、Se、TiO2等作為催化劑加速氧化［3］，縮短消煮時(shí)間；消煮液中銨的測(cè)定方法主要包括蒸餾滴定法、擴(kuò)散法和比色法［4］。NH4+的蒸餾和滴定是最常見(jiàn)的方法，即向消煮液中加入堿溶液，NH4+以NH3的形式揮發(fā)出被標(biāo)準(zhǔn)酸吸收，之后用標(biāo)準(zhǔn)酸液反向滴定。然而每個(gè)消煮的待測(cè)液需要15 min完成蒸餾-滴定過(guò)程，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)［5］，即使采用自動(dòng)定氮儀，蒸餾完成一個(gè)樣品也需5 min左右［6］。靛酚藍(lán)比色法也可用來(lái)測(cè)定消煮液中的NH4+，即堿性條件（pH值13.0左右）下銨和次氯酸根反應(yīng)生成氯胺，用硝普鈉催化，氯胺與水楊酸反應(yīng)形成藍(lán)綠色化合物，在波長(zhǎng)660 nm處比色測(cè)定［7］，此過(guò)程較為簡(jiǎn)單，不需要較大的空間和特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備［8］。

連續(xù)流動(dòng)分光光度法測(cè)定NH4+-N主要根據(jù)靛酚藍(lán)反應(yīng)的原理，連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)測(cè)定植物中全氮含量的結(jié)果與傳統(tǒng)蒸餾滴定法的結(jié)果沒(méi)有較大差異，連續(xù)流動(dòng)分析方法測(cè)試速度較快，樣品交叉污染小，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域［9-12］。土壤全氮采用凱氏法消煮，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定還缺乏相應(yīng)的研究，自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定結(jié)果與連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果之間關(guān)系還不甚清楚。選擇50個(gè)土壤樣品和2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土壤樣品用凱氏法消煮，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定消煮液中的NH4+，結(jié)果與自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定結(jié)果相比較，以探討連續(xù)流動(dòng)分析儀-靛酚藍(lán)比色法，測(cè)定凱氏消煮液中NH4+含量方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

農(nóng)田采集的土壤樣品于干凈通風(fēng)的室內(nèi)自然風(fēng)干，過(guò)0.149 mm篩［13］。土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為河南黃潮土GBW07413a（ASA-2a）和江西紅壤GBW07416a（ASA-5a）。

1.2 樣品消煮

稱取過(guò)0.149 mm篩的土壤樣品1.000 g于100 mL消煮管中，加入2.0 g催化劑（K2SO4∶CuSO4∶Se=100∶10∶1，混合均勻，磨細(xì)過(guò)0.149 mm篩）和5 mL濃硫酸，搖勻，置于自動(dòng)消解系統(tǒng)上加熱，升溫速度5℃/min，升溫至200℃，保持30 min，繼續(xù)加熱至340℃，直至消煮液澄清，繼續(xù)加熱1 h。冷卻至室溫，去離子水定容至100 mL，搖勻以備分析測(cè)試。

1.3 自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定消煮液中NH4+-N

1.3.1 儀器設(shè)備

自動(dòng)凱氏定氮儀的蒸餾儀型號(hào)：KjelFlexK-360，配置自動(dòng)滴定儀型號(hào)：DL15，滴定管體積20 mL，分辨率1/10 000，電極DG115-SC，電位分辨率0.1 mV。

1.3.2 蒸餾滴定過(guò)程

1.3.2.1 試劑配置 （1）40% 氫氧化鈉：溶解40.0 g 氫氧化鈉于100 mL去離子水中；（2）20 g/L 硼酸：稱取20.0 g 硼酸，溶于適量水中，定容至1 000 mL；（3）0.02 mol/L（1/2 H2SO4）：去離子水稀釋2.83 mL H2SO4到 5 L；（4）0.01 mol/L（1/2 H2SO4）：將0.02 mol/L（1/2 H2SO4）（即配置3）準(zhǔn)確稀釋2倍，并用硼砂溶液標(biāo)定之。方法如下：準(zhǔn)確稱取硼砂Na2B4O7·10H2O 1.907 1 g，溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)移定容至1 L容量瓶，搖勻，即為0.01 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取3份該溶液各25.00 mL于3個(gè)三角瓶中，以甲基紅做指示劑，以上述標(biāo)準(zhǔn)硫酸滴定至紅色終點(diǎn)，分別記錄消耗體積，計(jì)算0.01 mol/L（1/2 H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。

1.3.2.2 參數(shù)設(shè)置 準(zhǔn)確移取20.00 mL消煮液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)凱氏定氮儀專用蒸餾管中，打開(kāi)自動(dòng)凱氏定氮儀和配套的自動(dòng)滴定儀開(kāi)關(guān)，打開(kāi)冷凝用自來(lái)水閥，將滴定儀上pH電極插入定氮儀接收瓶中。選擇儀器“預(yù)先準(zhǔn)備程序”，進(jìn)行樣品測(cè)定方法編輯，設(shè)定主要參數(shù)：加入40%氫氧化鈉溶液30 mL、20 g/L硼酸接收液（pH值4.65）20 mL、蒸汽力度100%、反應(yīng)時(shí)間5 s、蒸餾時(shí)間250 s、蒸餾結(jié)束后自動(dòng)啟動(dòng)滴定，編輯完畢后保存，按定氮儀上啟動(dòng)開(kāi)始鍵，開(kāi)始自動(dòng)蒸餾滴定。儀器測(cè)定之前，選擇“清洗程序”，安裝干凈的空樣品管，清洗儀器3次，儀器空白值相差＜0.05 mL開(kāi)始測(cè)定。

1.4 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定消煮液中NH4+-N

1.4.1 儀器設(shè)備

連續(xù)流動(dòng)分析儀，配置有MT7化學(xué)模塊、操作軟件AACE，圖1為AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀結(jié)構(gòu)示意圖［14］。主要組成部分：進(jìn)樣系統(tǒng)、蠕動(dòng)泵、化學(xué)分析模塊、比色系統(tǒng)。

圖1 AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀結(jié)構(gòu)圖

1.4.2 操作過(guò)程及分析條件

1.4.2.1 試劑配制 （1）緩沖液：稱取35.8 g 磷酸二氫鈉，32.0 g氫氧化鈉，50.0 g酒石酸鉀鈉于600 mL水中，定容至1 000 mL；（2）水楊酸鈉溶液：40.0 g水楊酸鈉溶于600 mL蒸餾水，加入1.0 g硝普鈉，稀釋至1 000 mL，混均存放于棕色試劑瓶中；（3）次氯酸鈉溶液：將3.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯含量8%～10%）加入于60 mL蒸餾水中，稀釋至100 mL，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；（4）4% 硫酸溶液：移取40.0 mL濃硫酸稀釋至1 000 mL；（5）硫酸銨儲(chǔ)備液（N 1 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取4.717 g硫酸銨（120℃烘干2 h）溶于600 mL蒸餾水中，攪拌溶解，混合均勻，定容至1 000 mL。

1.4.2.2 參數(shù)設(shè)置 選擇防酸進(jìn)樣針和高濃度進(jìn)樣管，設(shè)置進(jìn)樣速率50個(gè)樣/h，進(jìn)樣與清洗比為2.0∶1，進(jìn)樣時(shí)間48 s，清洗時(shí)間24 s。儀器默認(rèn)設(shè)置基線和漂移校正，自動(dòng)基線參比為5%；比色濾光片波長(zhǎng)為660 nm，燈強(qiáng)度大于l 000 mV。樣品消煮液中含氮量在連續(xù)流動(dòng)分析儀線性測(cè)量范圍（＜N 50 mg/L）內(nèi)，無(wú)需稀釋。

1.4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 移取10.0 mL硫酸銨儲(chǔ)備液（即試劑配制5），定容至100 mL，混合均勻，即濃度為100 mg/L的NH4+-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL的NH4+-N標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶，用4%硫酸定容至50.0 mL。即NH4

+-N濃度為0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mg/L的NH4+-N系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述連續(xù)流動(dòng)分析儀條件進(jìn)行測(cè)定，儀器測(cè)定峰高與標(biāo)準(zhǔn)溶液NH4+-N濃度之間進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，其中 r2=0.999。

圖2 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH4+-N標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 統(tǒng)計(jì)分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

測(cè)量值Xi的算術(shù)平均值為樣品全氮估計(jì)值，標(biāo)準(zhǔn)偏差用貝塞爾公式計(jì)算［15-16］：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）=標(biāo)準(zhǔn)偏差/計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值×100；

分別采用連續(xù)流動(dòng)分析儀和自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定50個(gè)樣品和2個(gè)國(guó)家土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)全氮含量，兩測(cè)定結(jié)果之間做相關(guān)回歸分析。2個(gè)國(guó)家土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和3個(gè)土壤樣品分別用凱氏法消煮7次，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定消煮液中NH4+-N含量，以評(píng)估連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定凱氏消煮液中NH4+-N含量的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤全氮

連續(xù)流動(dòng)分析儀和自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)50個(gè)土壤樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定的土壤全氮范圍為0.68～2.06 g/kg，自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定的全氮范圍為0.71～1.95 g/kg。

圖3 連續(xù)流動(dòng)分析儀和自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定土壤全氮含量

對(duì)連續(xù)流動(dòng)分析儀和自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定土壤全氮含量進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖4可知，回歸方程為y（連續(xù)流動(dòng)分析儀-NH4+-N）=0.995 1x（自動(dòng)凱氏定氮儀-NH4+-N）+ 0.003 5，相關(guān)系數(shù)r=0.980（n=50，P＜0.01），斜率為 0.995 1 ，接近于 1。

圖4 連續(xù)流動(dòng)分析儀法和自動(dòng)凱氏定氮儀法結(jié)果相關(guān)分析

2.2 配對(duì)樣品t檢驗(yàn)

表1顯示，連續(xù)流動(dòng)分析儀與自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定土壤全氮平均值均為1.07 g/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 0.219、0.215，相關(guān)系數(shù) r為 0.980，且P＜0.01，兩測(cè)定結(jié)果之間極顯著相關(guān)；t檢驗(yàn)結(jié)果表明，雙尾檢驗(yàn)P＞0.05，兩種方法測(cè)定全氮含量沒(méi)有明顯差異，呈極顯著線性相關(guān)。

表 1 配對(duì)樣品t檢驗(yàn)

2.3 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定準(zhǔn)確度

同上述連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)試條件，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土（河南黃潮土和江西紅壤）凱氏法消煮、連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定消煮液中NH4+-N含量，每個(gè)樣品重復(fù)消煮7次，評(píng)估連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定全氮結(jié)果的準(zhǔn)確度（表2）。結(jié)果顯示，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)得兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.67%和3.09%，河南黃潮土氮含量為0.76 g/kg，在標(biāo)準(zhǔn)土確認(rèn)值（0.77±0.03）g/kg范圍內(nèi)；江西紅壤氮含量測(cè)定值為0.54 g/kg，介于江西紅壤氮含量標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)值（0.54±0.04）g/kg之間。因此，土壤全氮?jiǎng)P氏法消煮-連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH4+-N含量方法準(zhǔn)確度較高。

表2 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)全氮含量

2.4 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定精密度

3個(gè)土壤樣品凱氏法消煮7個(gè)重復(fù)，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定消煮液中NH4+-N含量，結(jié)果顯示測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.19%～1.46%之間，均小于5%（表3）。連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮精密度較好。

表3 連續(xù)流動(dòng)分析儀重復(fù)測(cè)定樣品全氮含量

2.5 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定方法檢出限

重復(fù)測(cè)定20個(gè)試劑空白實(shí)驗(yàn)，圖5為試劑空白測(cè)定結(jié)果。計(jì)算試劑空白測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，三倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差［17］作為檢出限估計(jì)值，即檢出限MLD=3×SD，得到本測(cè)定方法檢出限的N質(zhì)量濃度為0.128 mg/L。

圖5 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定空白信號(hào)值

3 討論

與傳統(tǒng)的全自動(dòng)蒸餾滴定法相比，連續(xù)流動(dòng)分析儀包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、蠕動(dòng)泵、化學(xué)分析模塊、比色系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)分析檢測(cè)［18］。連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮過(guò)程中，消煮液、緩沖液、水楊酸鈉、次氯酸鈉進(jìn)樣量分別為0.23、0.80（單管）、0.23、0.23 mL/min。圖1顯示，緩沖液的最大需求量為1.60 mL/min?？紤]到每天8 h工作時(shí)間和其他因素，上述試劑每天用量分別為110.4、768.0、110.4、110.4 mL，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮所用試劑量遠(yuǎn)小于自動(dòng)蒸餾滴定技術(shù)。試劑配制和儀器調(diào)試約需要2 h，按照進(jìn)樣速率50個(gè)/h，一天可以測(cè)定300樣次［6］。連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH4+-N節(jié)省時(shí)間和人力，效率較高。

95%置信區(qū)間成對(duì)樣品T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮和凱氏法測(cè)定土壤全氮含量一致。Junsomboon等［19］研究流動(dòng)注射系統(tǒng)（FIC法）測(cè)定牛奶、雞蛋和肉制品中凱氏氮含量，結(jié)果顯示FIC法測(cè)得結(jié)果和凱氏法測(cè)得結(jié)果之間具有極顯著線性相關(guān)，且方法檢出限為1 mg/L。本實(shí)驗(yàn)中連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH4+-N與自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定NH4+-N結(jié)果間具有顯著線性相關(guān)，回歸方程為y（連續(xù)流動(dòng)分析儀-NH4+-N）=0.995 1x（自動(dòng)凱氏定氮儀-NH4+-N）+0.003 5 ，相關(guān)系數(shù)r=0.980，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NH4+-N檢出限為0.128 mg/L。連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，精密度較高，且測(cè)定值均介于標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)值范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果較為準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮能夠克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以下，與全自動(dòng)凱氏蒸餾滴定法測(cè)定結(jié)果間無(wú)明顯差異，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度、精確度均較高。鑒于連續(xù)流動(dòng)分析儀法具有節(jié)省人力、節(jié)約試劑、提高工作效率等優(yōu)點(diǎn)，可適用于大批量土壤全氮含量的分析測(cè)定。