徐 杰,許修宏,門(mén)夢(mèng)琪,行國(guó)瑞,谷 猛,楊 陽(yáng),楊榮藝,邊鑫雨
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)
畜禽養(yǎng)殖業(yè)作為農(nóng)業(yè)重要組成部分,其糞便面源污染問(wèn)題已成為關(guān)注焦點(diǎn)[1]。目前,我國(guó)畜禽糞便年排放量超40億t,是工業(yè)有機(jī)污染物的4.1倍[2],畜禽糞便產(chǎn)生的化學(xué)需氧量(COD)遠(yuǎn)超工業(yè)廢水和生活污水COD總和[3],糞肥投入導(dǎo)致土壤Olsen-P增量為等量化肥的3倍[4-5]??梢?jiàn),如管理、利用不善,畜禽糞便將成為威脅環(huán)境的主要污染源[6]。利用畜禽糞便堆肥是資源化利用廢棄有機(jī)物的理想途徑[7-8],但仍存在許多問(wèn)題,如堆肥過(guò)程中的氨氣揮發(fā),造成空氣污染同時(shí)降低肥效,堆體升溫慢,導(dǎo)致纖維素等有機(jī)大分子降解不充分而延長(zhǎng)堆肥腐熟時(shí)間等[9-11]。通常采用向堆肥中加入特定功能微生物的方法來(lái)干預(yù)控制氨揮發(fā),提高堆肥氮素含量,促使堆體快速升溫,加快有機(jī)質(zhì)降解,從而加速堆肥腐熟進(jìn)程、提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)[12-14]。本試驗(yàn)采用多種篩選方法相結(jié)合,從土壤、秸稈、堆肥等不同來(lái)源樣品中分離得到4株同時(shí)具有使堆肥快速升溫和有效除臭潛力的纖維素降解菌株。將該4株菌株與本試驗(yàn)保藏的1株氨氧化細(xì)菌BM62(新型耐熱芽孢桿菌)按照不同比例配制成復(fù)合菌劑,并進(jìn)行堆肥功能驗(yàn)證,為將其應(yīng)用于大規(guī)模堆肥生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
1.1.1 功能菌株的富集和初篩
首先稱(chēng)取5 g樣品(土壤、秸稈、堆肥)加入到45 mL無(wú)菌水中,放入到恒溫振蕩器中振蕩30 min,取菌懸液10 mL,加入150 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中,在30℃、150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)2~3 d。取富集后的菌懸液用稀釋平板法進(jìn)行劃線(xiàn)分離純化,最后選擇48 h內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落較大的菌株進(jìn)入復(fù)篩。
1.1.2 纖維素降解菌的復(fù)篩
將初篩純化的菌株接種于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板培養(yǎng)基上,30℃恒溫箱中培養(yǎng)2~3 d,然后用質(zhì)量濃度為1 g/L的剛果紅溶液染色0.5 h,之后棄去染液,用濃度為1 mol/L的NaCl溶液脫色0.5 h,選取透明圈和菌落直徑比(D/d)值大的菌株進(jìn)行升溫除臭菌的復(fù)篩。
1.1.3 升溫菌、除臭菌的復(fù)篩
將秸稈剪成3~5 cm的小段,然后按照1∶3的質(zhì)量比與雞糞混合均勻,調(diào)節(jié)含水量為60%,即輕輕握住時(shí),指縫間有水滴析出,不成股流下為宜。將其放入到33 cm×17 cm的聚丙烯袋中,每袋接種分離菌株10 mL種子液,每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。使用未接種的空白袋作為對(duì)照,并在室溫下培養(yǎng)1至7 d,測(cè)量1~7 d的溫度變化情況。同時(shí)用感官法測(cè)定難聞氣味等級(jí)的大小,分為輕度(不臭或微臭)、中度(臭味較明顯)、重度(臭味強(qiáng)烈)3個(gè)等級(jí)。
1.2.1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察
將待測(cè)4菌株(A531、B622、A422、C631)劃線(xiàn)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)2 d,觀察菌落及菌體形態(tài)。
1.2.2 分子鑒定及同源性比較分析
將待測(cè)4菌株保藏斜面送至上海生工測(cè)定其16S rDNA序列。將測(cè)得菌株的16S rDNA序列利用Blast軟 件 中 的nucleotide blast與GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì),得出待測(cè)菌株的初步分類(lèi)結(jié)果。
1.3.1 斜面培養(yǎng)活化
將篩選得到的4株功能菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的氨氧化菌BM62的原始菌種分別接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上,將菌株A531、B622、A422和C631在30℃培養(yǎng)2 d,菌株BM62在50℃培養(yǎng)3 d使菌種活化。
1.3.2 一級(jí)種子培養(yǎng)
用滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和氨氧化菌培養(yǎng)基洗滌活化斜面至無(wú)菌三角瓶中振蕩培養(yǎng);菌株A531、B622、A422和C631在30℃、150 r/min培養(yǎng)24~48 h得到一級(jí)種子液;氨氧化菌BM62在50℃、120 r/min培養(yǎng)72~96 h得到一級(jí)種子液。
1.3.3 二級(jí)種子培養(yǎng)
按液體培養(yǎng)基的體積比為10%~15%的接種量,將一級(jí)種子分別接種于發(fā)酵罐中,菌株A531、B622、A422和C631在30~37℃、攪拌速度為150~200 r/min,通氣量為1∶(1~1.5)(V/V·min),培養(yǎng)2~3 d;氨氧化菌BM62在50℃、攪拌速度為120~150 r/min,通氣量為(0.5~1)∶1(V/V·min),培養(yǎng)4~5 d,制得二級(jí)種子。
1.3.4 菌種固體發(fā)酵培養(yǎng)
將各菌株的二級(jí)種子發(fā)酵液與滅菌麩皮以1∶3(mL/g)的體積質(zhì)量比混合發(fā)酵24~48 h后晾干,制成固體菌劑。
1.3.5 復(fù)合菌劑制備
將菌株A531、B622、A422、C631和BM62進(jìn)行拮抗試驗(yàn),結(jié)果表明該5株菌株不存在拮抗作用,隨后將其固體菌劑按照不同質(zhì)量比例混合,分別為1∶1∶1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1∶1 和 1∶2∶1∶2∶1 制成復(fù)合菌劑進(jìn)行堆肥功能性檢測(cè)。
(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,水1 000 mL。
(2)劃線(xiàn)分離培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL。
(3)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基:CMCNa 15 g,NH4NO31 g,酵母膏 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,H2O 1 000 mL,瓊脂 20 g。
(4)氨氧化菌(新型耐熱芽孢桿菌)培養(yǎng)基:(NH4)2SO45 g,KCl 4 g,MgSO42.5 g,CaCl21.85 g,NaCl 3 g,NaHCO342 g,蛋白胨60 g,牛肉膏40 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。
堆肥原料為新鮮雞糞和水稻秸稈,將水稻秸稈鍘成3~5 cm小段,與鮮雞糞按照1∶3~4的質(zhì)量比混合均勻,調(diào)節(jié)水分含量至60%~65%,堆成發(fā)酵堆;邊建堆邊添加菌劑,所述菌劑的量為(8~9)×109CFU/kg堆肥原料,接種后均勻混合堆體材料;當(dāng)溫度上升到45℃以上時(shí)翻堆,每3 d翻堆1次,溫度下降到35℃以下后每5 d翻1次,直至堆體溫度下降至環(huán)境溫度結(jié)束發(fā)酵。
通過(guò)升溫、除臭和纖維素降解功能等多重篩選試驗(yàn),從不同來(lái)源(土壤、堆肥、秸稈)樣品中共分離純化獲得28株具有纖維素降解能力,同時(shí)具有使堆肥快速升溫和有效除臭潛力的細(xì)菌,其中編號(hào)為A531、B622、A422和C631這4株菌株的各項(xiàng)功能均較為突出,具體篩選結(jié)果見(jiàn)表1。
將此4株細(xì)菌劃線(xiàn)于牛肉膏-蛋白胨平板培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落及菌體形態(tài),并進(jìn)行基本理化性質(zhì)檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2和表3。結(jié)果表明該4株菌株的菌落、菌體特征及各項(xiàng)理化性質(zhì)均存在一定差異,初步判斷這4株菌株為分類(lèi)不同的菌種。
表1 功能菌株篩選結(jié)果
表2 功能菌株菌落及菌體特征
表3 功能菌株基本生理生化特性
對(duì)4株待測(cè)菌株16S rDNA序列的V3、V4區(qū)與GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果見(jiàn)表4。其中菌株A531、C631的最相近菌株分別為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ATCC14579(T)和白色芽孢桿菌(Bacillus albus)N35-10-2(T),相似性分別為99.45%和98.89%。而菌株A422和B622的最相近菌株分別為莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)RO-H-1(T)和皮特不動(dòng)桿菌(Acinetobacter pittii)CIP 70.29(T),其16S rDNA序列相似性?xún)H有94.11%和94.48%。根據(jù)現(xiàn)有界定新種屬的規(guī)定,16S rDNA序列相似性在90%~95%為新屬[15-16],因此這兩株細(xì)菌很可能是與莫哈韋芽孢桿菌和皮特不動(dòng)桿菌相近的新屬細(xì)菌,其具體分類(lèi)鑒定還有待進(jìn)一步試驗(yàn)測(cè)定。
表4 功能菌株分子鑒定比對(duì)結(jié)果
將菌株A531、A422、B622、C631與本實(shí)驗(yàn)室保藏的氨氧化細(xì)菌Aliibacillus thermotoleransBM62(新型耐熱芽孢桿菌)分別進(jìn)行拮抗試驗(yàn),結(jié)果顯示該5株細(xì)菌并無(wú)明顯拮抗現(xiàn)象。隨后將該5株細(xì)菌按照不同比例配制成復(fù)合菌劑進(jìn)行小型堆肥試驗(yàn),以驗(yàn)證其堆肥升溫除臭及纖維素降解效果。
2.3.1 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1的堆肥
將菌株A531、A422、B622、C631和BM62分別制成固體菌劑,按照1∶1∶1∶1∶1的比例復(fù)合接種進(jìn)行堆肥試驗(yàn)。
堆肥結(jié)果顯示,接種菌劑的堆肥在堆制后第2 d就進(jìn)入高溫分解階段(>45℃)(圖1),并持續(xù)到第12 d,之后溫度逐漸下降,20 d時(shí)降至35℃以下。整個(gè)堆肥過(guò)程中,高溫期(2~12 d)維持11 d;自然堆肥的堆體溫度雖然高于室溫,但在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)未能進(jìn)入高溫期??梢?jiàn),接種菌劑可明顯提高堆肥化過(guò)程中,尤其是堆肥前期的微生物代謝活性,從而提高堆體溫度,為有機(jī)物大分子的降解提供溫度保證,加快堆肥腐熟進(jìn)程。
由表5可知,堆肥結(jié)束時(shí),與對(duì)照堆肥相比,添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高19.83%,總氮損失率降低10%,NO2-含量增加46.6%,NH3揮發(fā)率降低35.5%,表明此復(fù)合菌劑可有效促進(jìn)堆肥中纖維素類(lèi)物質(zhì)降解,減少NH3揮發(fā),增加NO2-含量,從而減少氮素?fù)p失,有效降低難聞氣味。
圖1 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1的堆肥過(guò)程中溫度變化
表5 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1堆肥中各理化指標(biāo)變化
2.3.2 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥
將菌株A531、A422、B622、C631和BM62制成的固體菌劑按照2∶2∶1∶1∶1的比例混合接種堆肥,結(jié)果表明接種菌劑的堆肥同樣也是在堆制后第2 d就進(jìn)入高溫分解階段(>45℃)(圖2),高溫期持續(xù)了14 d,比接種復(fù)合菌劑比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥延長(zhǎng)了3 d。
圖2 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥過(guò)程中溫度變化
由表6可知,堆肥結(jié)束時(shí),與對(duì)照堆肥相比,添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高了21.73%,總氮損失率減少8.1%,NO2-含量增加39.7%,NH3揮發(fā)減少23.1%。與接種復(fù)合菌劑比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥結(jié)果相比較,可以看出,此種配比的復(fù)合菌劑處理雖然延長(zhǎng)了高溫期,提高了纖維素的降解率,但是也增加了總氮的損失率。
2.3.3 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥
將菌株A531、A422、B622、C631和BM62按照1∶2∶1∶2∶1的比例復(fù)配菌劑接種堆肥,結(jié)果顯示接種菌劑的堆肥同樣也是在堆制后第2 d就進(jìn)入高溫分解階段(>45℃)(圖3),高溫期持續(xù)了14 d,與接種復(fù)合菌劑比例2∶2∶1∶1∶1的堆肥溫度表現(xiàn)相似。
表6 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1堆肥中各理化指標(biāo)變化
圖3 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥過(guò)程中溫度變化
由表7可知,堆肥結(jié)束時(shí),與對(duì)照堆肥相比,添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高了18.86%,總氮損失率減少了11.2%,NO2-含量增加了49.1%,NH3揮發(fā)減少42.6%。與接種復(fù)合菌劑比例為1∶1∶1∶1∶1和比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥結(jié)果相比,此接種比例的復(fù)合菌劑使堆肥過(guò)程中的總氮損失最少,NH3揮發(fā)減少最多,纖維素降解率與前兩種復(fù)合菌劑處理結(jié)果相當(dāng)。此試驗(yàn)結(jié)果表明,接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥效果相對(duì)最好。
表7 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1堆肥中各理化指標(biāo)變化
經(jīng)多重篩選試驗(yàn)得到4株同時(shí)具有快速升溫除臭并有效降解纖維素物質(zhì)的芽孢桿菌屬細(xì)菌菌株A531、B622、A422和C631,將其與本實(shí)驗(yàn)室保存的氨氧化菌-新型耐熱芽孢桿菌Aliibacillus thermotoleransBM62按照3種不同比例配制成復(fù)合菌劑進(jìn)行堆肥功能驗(yàn)證試驗(yàn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果充分表明此復(fù)合菌劑兼具快速發(fā)酵產(chǎn)熱、生物除臭保氮、快速有效分解纖維素大分子等多種功效,可使畜禽糞便堆肥快速升溫,明顯降低不愉快氣味,降低堆肥中氮素?fù)p失,降低難降解有機(jī)物含量,從而加快堆肥物料的腐熟速度,提升堆肥產(chǎn)品品質(zhì)。可用于生產(chǎn)生物有機(jī)肥,降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本,同時(shí)解決畜禽糞便引起的環(huán)境污染,具有很好的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。
4.1 經(jīng)多重篩選試驗(yàn)得到4株同時(shí)具有快速升溫除臭并有效降解纖維素物質(zhì)的細(xì)菌A531、A422、B622和C631,其中菌株A531和C631經(jīng)初步鑒定分別屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和白色芽孢桿菌(Bacillus albus),菌株A422和B622的分類(lèi)名稱(chēng)待定。
4.2 小型堆肥功能驗(yàn)證試驗(yàn)表明此4株功能菌株可與本實(shí)驗(yàn)室保存的氨氧化菌-新型耐熱芽孢桿菌Aliibacillus thermotoleransBM62配制成功能互補(bǔ)的復(fù)合菌劑,該菌劑可使堆肥快速升溫除臭,并使纖維素有效降解。