趙躍榮

尿血寧合劑為我院的中藥制劑，由女貞子、墨旱蓮、小薊、生側(cè)柏、馬鞭草、石韋等藥物制成，本藥物具有滋陰補(bǔ)腎、涼血止血的功效，臨床用于腎炎血尿（含鏡下血尿）[1]。本方中女貞子為君藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝的功效。紅景天苷是女貞子保護(hù)腎臟功能的重要活性成分[2]。墨旱蓮為臣藥，具有涼血止血、收斂止癢、補(bǔ)益肝腎的功效，其含有的木樨草苷是重要活性成分[3]。尿血寧合劑現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還停留在薄層掃描等定性鑒別水平，遠(yuǎn)不能適應(yīng)中藥質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)的發(fā)展，所以，亟需建立尿血寧合劑主要活性成分定量測(cè)定的方法。研究人員以女貞子中紅景天苷和墨旱蓮中的木樨草苷為檢測(cè)的指標(biāo)性成分[4-5]，建立了對(duì)尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的方法，研究如下。

1 儀器與材料

2695 型高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器（Waters公司），US-22D型超聲波清洗器（蘇州市炬虹超聲波設(shè)備有限公司）。

紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)：120325-201706，南京森貝伽生物科技有限公司），木樨草苷對(duì)照品（批號(hào)：101124-201708，武漢天植生物技術(shù)有限公司），乙腈（色譜純，濟(jì)南創(chuàng)世化工有限公司），磷酸（分析純，濟(jì)南蕭試化工有限公司），甲醇（分析純，南京維之誠(chéng)化學(xué)試劑有限公司），重蒸水（本院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制），尿血寧合劑為南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院自制（批號(hào)分別為170915、171013、171116）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Athena C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用混合流動(dòng)相，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，見(jiàn)表1；柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按照紅景天苷色譜峰計(jì)算和按照木樨草苷峰計(jì)算均不低于3 500。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取紅景天苷對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為400 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液A。另取木樨草苷對(duì)照品8 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為320 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液B。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液A和對(duì)照品儲(chǔ)備液B各10 mL，置于同一50 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，制得紅景天苷和木樨草苷的質(zhì)量濃度分別為80 mg·L-1和64 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密量取尿血寧合劑5 mL，置50 mL量瓶中，加體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液30 mL，超聲處理10 min，取出，放冷，加體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液定容至刻度，搖勻，以2500 r·min-1的速度離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

按尿血寧合劑的處方和制備方法，分別制備不含女貞子或墨旱蓮藥材的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下所述的供試品溶液的制備方法制成相應(yīng)的陰性樣品溶液，備用。

2.5 方法專屬性考察

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、不含女貞子的陰性樣品溶液、不含墨旱蓮陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件下各進(jìn)樣10 μL，分別記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，紅景天苷的保留時(shí)間為7.6 min，木樨草苷的保留時(shí)間為20.4 min，不含女貞子陰性樣品溶液在紅景天苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，不含墨旱蓮陰性樣品溶液在木樨草苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法專屬性較好。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液A、對(duì)照品儲(chǔ)備液B各0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL置于同一25 mL量瓶中，用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，制成紅景天苷、木樨草苷梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得紅景天苷回歸方程為Y=3.268×104X+8.267×102，r=0.999 7，紅景天苷質(zhì)量濃度在9～150 mg·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；木樨草苷回歸方程為Y=4.158×104X-5.546×102，r=0.999 8，木樨草苷質(zhì)量濃度在8～130 mg·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，經(jīng)計(jì)算，紅景天苷色譜峰面積的RSD為0.95%（n=6），木樨草苷色譜峰面積的RSD為1.06%（n=6）。

2.8 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（170915）尿血寧合劑樣品5份，按“2.3” 項(xiàng)下所述的供試品溶液的制備方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，紅景天苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.24%（n=5）；木樨草苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.36%（n=5）。

圖1 HPLC 色譜圖

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取供試品溶液分別于0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，經(jīng)計(jì)算，紅景天苷峰面積RSD為1.16%，木樨草苷峰面積RSD為1.33%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的尿血寧合劑樣品（批號(hào)：170915）1.0 mL，置10 mL量瓶中，精密加入紅景天苷、木樨草苷對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下所述的供試品溶液的制備方法制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，按“2.1”條色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品測(cè)定

取3批樣品，每批取3份，按“2.3”項(xiàng)下所述的供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算紅景天苷、木樨草苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

尿血寧合劑中女貞子為君藥，女貞子中含有的紅景天苷具有較強(qiáng)的藥理活性，研究表明，紅景天苷能抑制鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠腎纖維化，對(duì)大鼠過(guò)度運(yùn)動(dòng)后腎損傷也具有預(yù)防保護(hù)作用。墨旱蓮對(duì)腎臟也具有較強(qiáng)保護(hù)作用，研究表明，墨旱蓮提取物能有效改善STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的相關(guān)生化指標(biāo)，并對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，木樨草苷是墨旱蓮中含有的重要活性成分，所以，對(duì)尿血寧合劑中的木樨草苷和紅景天苷進(jìn)行含量測(cè)定，能夠反映出制劑的質(zhì)量，對(duì)于提高制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具有重要的意義。

為同時(shí)測(cè)定木樨草苷和紅景天苷的含量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，試用體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液、體積比為20：80的甲醇-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液、體積比為50：50的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，以體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液的混合溶液為流動(dòng)相，紅景天苷與木樨草苷與其他組分均能達(dá)到基線分離。

文獻(xiàn)報(bào)道，紅景天苷的最大吸收波長(zhǎng)為224 nm、275 nm[9-10]，木樨草苷的最大吸收波長(zhǎng)為330 nm、350 nm[11-12]；本研究分別對(duì)紅景天苷和木樨草苷進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明，紅景天苷在275 nm處有最大吸收，木樨草苷在275 nm、330 nm處有最大吸收，因紅景天苷在330 nm處紫外吸收極低，故選擇二者的共同最大吸收波長(zhǎng)275 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

本研究還比較了0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1三個(gè)流速，分別對(duì)20℃、25℃、30℃ 三個(gè)柱溫時(shí)，紅景天苷和木樨草苷的分離度進(jìn)行比較，最后確定在流速為1.0 mL·min-1、柱溫為25℃，以乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，能夠達(dá)到比較滿意的分離效果。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫順序

表2 紅景天苷、木樨草苷的加樣回收率試驗(yàn)（n=9）

表3 尿血寧合劑中紅景天苷、木樨草苷的含量（n=3）

本研究以尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷的含量為指標(biāo)，通過(guò)高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定女貞子、墨旱蓮2種藥材的含量測(cè)定方法；經(jīng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和方法學(xué)驗(yàn)證研究，樣品中上述2種成分能較好分離，該檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可行，可作為尿血寧合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法之一，用于本制劑的質(zhì)量控制。

根據(jù)本研究測(cè)定女貞子、墨旱蓮2種藥材的含量均值，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，參考回收率實(shí)驗(yàn)取值范圍85.0%～115.0%，以測(cè)定均值的85%為限度，暫定每1 mL尿血寧合劑中紅景天苷和木樨草苷含量分別不得低于0.57 mg和0.46 mg。