葛寶健 王倩

摘要：目的 探討全反式維甲酸（ATRA）對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法??MTT法檢測(cè)ATRA作用于LoVo細(xì)胞48h后的生長(zhǎng)抑制率及IC50;劃痕實(shí)驗(yàn)觀察ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果 ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞的IC50=4.493?g/ml，且呈現(xiàn)濃度依賴性抑制LoVo細(xì)胞增殖;ATRA可明顯抑制LoVo細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性。結(jié)論 全反式維甲酸（ATRA）能夠顯著抑制大腸癌LoVo細(xì)胞的增殖和遷移能力。

關(guān)鍵詞： 全反式維甲酸;大腸癌;增殖;遷移

【中圖分類號(hào)】R574.6 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ???【文章編號(hào)】2107-2306（2019）04-070-02

大腸癌占消化系統(tǒng)腫瘤疾病的第二位，全球每年有大約60萬(wàn)患者死亡，其中男性患病機(jī)率高于女性。當(dāng)前臨床治療主要以手術(shù)為主，輔以放療和化療，但患者的術(shù)后5年總生存率僅50%左右，而術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的患者5年生存率僅為19%^[1-2]。因此，尋找有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物，已經(jīng)迫在眉睫。?全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）是維生素A的一種衍生物，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于皮膚科疾病的治療?，F(xiàn)有研究證實(shí)，ATRA不僅對(duì)皮膚病有效，對(duì)多種惡性腫瘤如白血病、黑色素瘤、肝癌等都有抑制作用^[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)ATRA的適藥濃度以及抑癌效果，探究其對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為其參與大腸癌疾病的治療提供依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

人大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供。ATRA、MTT、DMSO（Sigma 公司），RMPI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（HyClone公司），胰酶、青鏈霉素（Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物準(zhǔn)備

細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清）， 37℃、5%CO2、濕度100%，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。5mg ATRA，用DMSO配成5mg/ml濃度藥物母液，分裝于EP管，-20℃冰箱避光貯存。使用時(shí)，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。

1.2.2 MTT檢測(cè)ATRA 對(duì)LoVo 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率

96孔板接種細(xì)胞8000個(gè)/孔，設(shè)置空白組（培養(yǎng)液）、對(duì)照組（細(xì)胞）及藥物組（細(xì)胞+ATRA：0，0.625，1.25，2.5，5，10，20?g/ml），每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，酶標(biāo)儀492nm 處測(cè)吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=[1-（藥物組-空白組OD值）/（對(duì)照組-空白組）]×100%，篩選用藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3劃痕試驗(yàn)檢測(cè)ATRA 對(duì)LoVo細(xì)胞的遷移影響

6孔板接種細(xì)胞2×10⁵個(gè)/孔，設(shè)對(duì)照組和藥物組（2.5，5，10?g/ml），培養(yǎng)細(xì)胞密度至80%時(shí)，用無(wú)菌槍頭劃痕，PBS洗滌細(xì)胞3次，拍照記錄初始劃痕間距（A0），培養(yǎng)48 h后，再次拍照統(tǒng)計(jì)相同位置劃痕間距（A48）。細(xì)胞遷移率=（A0-A48）/A0 × 100%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞增殖作用的影響

ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞的抑制率隨著濃度升高而增高，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），篩選半抑制藥物濃度（IC50）為4.493?g/ml（圖1）。以IC50為標(biāo)準(zhǔn)選取2.5、5、10 ?g/ml三個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響

ATRA處理LoVo細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞劃痕間距均變窄，對(duì)照組細(xì)胞劃痕接近消失，藥物組藥物濃度越高，劃痕區(qū)細(xì)胞數(shù)量越少（圖2）。四組細(xì)胞遷移率分別為70%、25%、14%、9%（48h），藥物組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3），提示ATRA能抑制LoVo細(xì)胞的遷移，且具有濃度依賴性。

3、討論

大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是目前臨床癌癥患者術(shù)后死亡率提高的一個(gè)重要因素，而腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程涉及腫瘤細(xì)胞黏附、遷移以及腫瘤微環(huán)境變化等多個(gè)環(huán)節(jié)^[4]，如何抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)全反式維甲酸（ATRA）作用LoVo細(xì)胞的結(jié)果顯示：ATRA抑制LoVo細(xì)胞的增殖的遷移過(guò)程，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)中，ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞的遷移能力也具有顯著地抑制效果，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，但5?g/ml與10?g/ml的抑制率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5?g/ml的藥物劑量也進(jìn)一步驗(yàn)證了前期實(shí)驗(yàn)得出的半劑量藥物濃度（IC50=4.493?g/ml）的準(zhǔn)確性，臨床上長(zhǎng)時(shí)間和大劑量的用藥會(huì)嚴(yán)重增加耐藥性和毒副作用，此結(jié)果具有指導(dǎo)意義，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥基礎(chǔ)。

綜上所述，ATRA對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞的增殖和遷移具有良好的抑制作用，但其引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，為應(yīng)用ATRA臨床治療大腸癌提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[3] Alizadeh F，Bolhassani A，Khavari A，et al.Retinoids and their biological effects against cancer.Int Immunopharmacol，2014，18（ 1） ： 43-49.

[4] Forner A，Reig M，Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet，2018，391（10127）：1301-1314.