袁鯤，譚鑫，吳芳蘭，吳瑛，吳東波

（長沙市第一醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410005）

乳腺癌現(xiàn)為女性惡性腫瘤發(fā)病率占首位的疾病，嚴(yán)重危害女性健康[1-2]。乳腺癌的臨床預(yù)后與是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，現(xiàn)在認(rèn)為鞘氨醇激酶（sphingosine kinases,SPHKs）是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素[3-4]，目前發(fā)現(xiàn)鞘氨醇激酶1（SPHK1）與腫瘤發(fā)病有重要關(guān)系，包括腫瘤增殖、抵抗凋亡及轉(zhuǎn)移[5-6]。而SPHK1與乳腺癌臨床遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)研究鮮少報(bào)道，因此，為明確SPHK1與乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移相關(guān)性，是否可以作為早期診斷指標(biāo)，特做以下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月—2018年6月長沙市第一醫(yī)院乳腺癌、乳腺良性腫瘤及健康體檢者骨髓（骨髓來源本院檢驗(yàn)科骨髓細(xì)胞形態(tài)室）。乳腺癌患者90例。年齡（39±12）歲；均行病理檢查確診，術(shù)前未接受放射及化學(xué)治療，常規(guī)體檢并排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。按國際抗癌聯(lián)盟（union for international cancer control,UICC）2010年腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[7]：Ⅰ期28例，Ⅱ期41例，Ⅲ期21例。良性乳腺腫瘤患者52例，排除身體其他部位惡性腫瘤。年齡（34±9）歲；乳腺纖維腺瘤28例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤24例。健康體檢者20例，為單純?nèi)橄僭錾?，年齡（32±5）歲。健康對(duì)照組部分患者因癥狀較重，疑乳腺腫塊性質(zhì)，在行排癌檢查的同時(shí)，同意行骨髓檢測；部分患者伴有血象異常，同意行骨髓檢測，后復(fù)查血象正常。3組間患者年齡差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)骨髓取樣三點(diǎn)取材法在患者雙側(cè)髂前上棘與胸骨處行骨髓穿刺術(shù)，取骨髓液10 ml，置入-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativerealtime polymerasechain reaction,qRT-PCR）檢測各組骨髓中 SPHK1 mRNA 的表達(dá) 取骨髓液加入 Trizol，按說明書提取總RNA，采用RT-PCR試劑盒及real-time PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）對(duì)樣本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。引物序列由大連寶生物工程有限公司合成：SPHK1正向?yàn)?5'-CTTCCTT GAACCATTATGC-3'，反向?yàn)?5'-CCGATACTTCTCACT CTC-3'，擴(kuò)增片段長度為426 bp。β-actin引物序列正向?yàn)?'-GTGGGCATGGGTCAGAAG-3'，反向?yàn)?'-G AGGCGTACAGGGATAGCAC-3'，擴(kuò)增片段長度為576 bp；逆轉(zhuǎn)錄體系 20 μl，反應(yīng)條件：42℃下擴(kuò)增30 min，95℃下水浴 2 min，置入 -20℃冰箱冷凍保存。采用美國 Applied Biosystemes公司 ABI PRISM7 300 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTFQ-PCR）儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系 20 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 1 min 30 s，隨后 95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，65℃延伸 1 s，共40個(gè)循環(huán)。美國 Thermo Electron Corporation 公司連續(xù)光譜熒光酶標(biāo)儀自動(dòng)進(jìn)行樣本檢測，結(jié)果＜103copy/ml為陰性，≥ 103copy/ml為陽性。

1.2.3 Westernblotting 檢測骨髓中 SPHK1 蛋白的表達(dá) 提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒[生工生物工程(上海）股份有限公司]檢測蛋白濃度，配制10%分離膠及5%堆積膠，每孔加入等量待測蛋白。SDSPAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，室溫封閉2 h，加入SPHK1多克隆抗體（1∶400，美國Santa Cruz公司）4℃過夜，HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h。用凝膠圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）進(jìn)行灰度分析，計(jì)算積分光密度（IOD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，則采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過計(jì)算骨髓SPHK1對(duì)乳腺癌診斷的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值（PPV）、陰性預(yù)測值（NPV）、陽性似然比（positive likelihood ratio， PLR）和陰性似然比（negative likelihood ratio,NLR）評(píng)估診斷符合率。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)評(píng)估診斷一致性，若0.75＜κ≤1.00，說明一致性極好；0.40＜κ≤0.75，一致性好；0.00≤κ≤0.40，則一致性差。

2 結(jié)果

2.1 各組SPHK1在骨髓中的表達(dá)

90例乳腺癌組患者中骨髓SPHK1陽性68例（75.6%），52例良性乳腺腫瘤組患者骨髓SPHK1陽性7例（13.5%），20例健康對(duì)照組中骨髓SPHK1陽性1例（5.0%），3組間陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=67.119，P =0.000）。

2.2 各組SPHK1 mRNA和蛋白在骨髓中的表達(dá)

90例乳腺癌組患者SPHK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（3.015±0.943）高于良性乳腺腫瘤組患者（0.974±0.397）和健康對(duì)照組（0.482±0.093），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =8.423，P =0.000）；良性乳腺腫瘤組患者SPHK1 mRNA表達(dá)量與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（見圖1）。90例乳腺癌組患者SPHK1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.657±0.198），良性乳腺腫瘤組患者為（0.963±0.132），健康對(duì)照組為（0.749±0.126），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =4.768，P =0.000）；良性乳腺腫瘤組SPHK1蛋白相對(duì)表達(dá)量與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（見圖2）。

2.3 骨髓SPHK1的檢測診斷乳腺癌的符合率

ROC曲線下面積為0.887，SPHK1蛋白確定良惡性腫塊的臨界值為1.1247。以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，骨髓SPHK1診斷敏感性為75.6%，特異性為86.5%。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)評(píng)估骨髓SPHK1診斷乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的一致性，κ值為0.59＞0.4，表示具有較好的一致性。見表1。

圖1 各組骨髓中SPHK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2 SPHK1蛋白在各組骨髓中的表達(dá)

表1 骨髓SPHK1的檢測診斷乳腺癌的符合率

3 討論

SPHK將鞘氨醇轉(zhuǎn)化為鞘氨醇1磷酸（S1P），S1P可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使以及可結(jié)合特異性受體的細(xì)胞外配體。而產(chǎn)生的S1P，反過來可以作為G蛋白偶聯(lián)S1P受體1-5（S1PR1-S1PR5）家族的配體，并調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遷移，促進(jìn)血管生成，在細(xì)胞增殖、遷移和存活中起關(guān)鍵作用[8-9]。SPHK具有2種不同功能的異構(gòu)體，SPHK1和SPHK2，這2種形式已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中以SPHK1更為明顯，SPHK1是細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)鞘脂類代謝的重要限速酶，可能成為腫瘤新的治療靶點(diǎn)[10-12]。有研究認(rèn)為SPHK1在消化道腫瘤中與腫瘤晚期進(jìn)展相關(guān)，可以作為消化道腫瘤患者死亡的預(yù)測因子[13-14]。在原發(fā)性肝癌中，SPHK1表達(dá)高于癌旁組織，且高表達(dá)SPHK1蛋白的肝癌患者生存期較短。認(rèn)為SPHK1是肝癌的一個(gè)潛在分子靶點(diǎn)，有助于判斷病情的復(fù)發(fā)和預(yù)后[15]。近年來有研究認(rèn)為，SPHK1高表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有重要關(guān)系，可能是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖的重要因子，這亦提示SPHK1蛋白與腫瘤增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能有關(guān)[16-17]。

熊偉等[18]發(fā)現(xiàn)，ABCB5與SPHK1在乳腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，且SPHK1蛋白表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤大小、月經(jīng)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及HER-2表達(dá)有關(guān)，認(rèn)為其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中有一定作用，其檢測可輔助乳腺癌的診斷和病情評(píng)估。微陣列分析結(jié)果提示乳腺癌患者SPHK1異構(gòu)體表達(dá)高水平預(yù)示預(yù)后較差[19]。研究也證實(shí)SPHK1在ER陽性乳腺癌中高表達(dá)，并與ER受體相互作用[20]；SPHK1/S1P信號(hào)通路也被報(bào)道能促進(jìn)內(nèi)分泌藥物耐藥性且促進(jìn)雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生、活化及存活。但有關(guān)SPHK1與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組患者骨髓中SPHK1陽性率高于良性乳腺腫瘤組及健康對(duì)照組；乳腺癌組患者SPHK1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于良性乳腺腫瘤組患者和健康對(duì)照組；骨髓SPHK1診斷乳腺癌的敏感性為75.6%，特異性為86.5%。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)κ值為0.59＞0.40，具有較好的一致性。顯示SPHK1在乳腺癌患者骨髓中存在表達(dá)異常，且與病理診斷符合情況較為一致。

表達(dá)SPHK1的成纖維細(xì)胞可獲得轉(zhuǎn)化表型并促進(jìn)腫瘤發(fā)生，提示SPHK1具有致癌活性，且SPHK1在多種人類腫瘤中高表達(dá)，此外在某些腫瘤中其表達(dá)上調(diào)與臨床預(yù)后較差密切相關(guān)，抑制SPHK1表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的增殖，SPHK1的活化是細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵因素。因此，通過檢測腫瘤的微轉(zhuǎn)移可以監(jiān)測腫瘤發(fā)展趨勢，在腫瘤可能轉(zhuǎn)移的早期進(jìn)行干預(yù)，消滅潛在微轉(zhuǎn)移灶，對(duì)乳腺癌患者預(yù)后具有極大的臨床意義。SPHK1可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，因而乳腺癌患者骨髓中SPHK1表達(dá)升高，使檢測骨髓微轉(zhuǎn)移成為可能。

綜上所述，SPHK1可作為檢測乳腺癌患者骨髓轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志之一，有助于早期檢測乳腺癌患者的骨髓轉(zhuǎn)移，可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。